DNA纳米探针的构建及其在细胞凋亡成像分析中的应用

作     者：林华容 

作者单位：西南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李春梅

授予年度：2022年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 07[理学] 070205[理学-凝聚态物理] 070302[理学-分析化学] 0703[理学-化学] 10[医学] 0702[理学-物理学] 

主      题：DNA纳米探针 细胞凋亡 miR-630 MnSOD mRNA 成像分析 

摘      要：细胞凋亡,又名程序性细胞死亡,对细胞的生长、增殖有着重大影响,在生物体内受到凋亡相关分子的严格调控。细胞凋亡的平衡一旦被打破(凋亡过度或凋亡不足),则会产生各种疾病问题,比如恶性肿瘤、移植排斥反应、神经退行性疾病等。因此构建简单、灵敏的分析方法监测细胞凋亡过程中凋亡相关分子含量变化,对于进一步了解凋亡过程、凋亡机制、凋亡途径、药物疗效评价等具有重要意义。传统的细胞凋亡检测方法往往操作繁琐、耗时,且需要固定或裂解细胞后提取凋亡相关标志物,难以对凋亡过程进行原位实时动态监测。同时,细胞内成分复杂,而凋亡标志物往往丰度较低,要求分析方法具备较高的准确度和灵敏度。DNA具有易合成、生物相容性好等诸多优点,近年来也得到了广泛的关注。但细胞内环境复杂,尤其是核酸酶等会影响DNA结构的稳定性和功能,因此如何构建稳定性好、灵敏度高的DNA纳米探针,实现细胞内凋亡标志物的检测和成像分析,仍然极具挑战。基于以上问题,本文构建了两种生物相容性好、稳定性高的DNA纳米探针,利用纳米金属表面能量转移(Nanometal surface energy transfer,NSET)降低背景信号,结合空间限制和催化发卡自组装(Catalyzed hairpin assembly,CHA)循环放大功能,实现凋亡相关分子的灵敏检测。同时,借助具有实时无创、高时空分辨率等优点的荧光成像技术,对药物诱导细胞凋亡过程中细胞内低丰度的凋亡相关分子含量变化进行原位实时监测。开展的研究内容具体如下:1.Au NPs-DNA球核酸纳米探针的构建及其在细胞凋亡过程中miR-630的实时成像分析中的应用在生物体内,miRNA参与了分化、凋亡等多个生理过程,Micro RNAome分析表明miR-630参与了凋亡过程的调节。因此,本研究构建了一种Au NPs-DNA球核酸纳米探针(Au NPs-DNA),用于实时监测细胞凋亡过程中miR-630的含量变化。在此研究中,设计了一条与miR-630完全互补的DNA序列(reporter,TAMRA-DNA),以及一条与reporter部分互补的DNA序列(blocker,SH-DNA),以金纳米颗粒(Gold nanoparticles,Au NPs)为载体,两条DNA在杂交后通过金-硫键偶联到Au NPs表面,组装形成Au NPs-DNA。Au NPs与TAMRA之间发生NSET,导致TAMRA荧光被猝灭。当miR-630存在时,其会与TAMRA-DNA杂交形成另一条双链结构并从Au NPs-DNA中释放,产生荧光信号恢复,利用该信号变化构建miR-630的检测方法,实现了miR-630快速(10分钟)、宽线性范围检测(0.5–120nmol/L)。由于Au NPs对其表面DNA具有保护作用,可使DNA免于核酸酶降解,长时间保持稳定。将Au NPs-DNA应用于A549细胞凋亡过程中miR-630的实时监测,结果表明在星形孢菌素(STS)诱导凋亡的过程中,细胞内miR-630的表达逐渐升高。研究还发现,用不同的抗肿瘤药物诱导凋亡时,miR-630的表达也有一定升高,和文献报道相一致,进一步表明miR-630可能参与了细胞凋亡的调节。以上结果表明,Au NPs-DNA具有低背景、稳定等优点,实现了miR-630的快速灵敏检测及其在细胞凋亡过程中的成像分析,有望用于凋亡机制研究及抗癌药物筛选等。2.DNA三棱柱组装体的构建及其在细胞凋亡过程中MnSOD mRNA的实时监测中的应用mRNA在生物体内具有指导蛋白合成的功能,其中MnSOD mRNA作为在凋亡途径中的上游信号分子吸引了研究者们的关注。由于细胞内MnSOD mRNA丰度较低,因此要求分析方法具备高的灵敏度。因此,本研究基于DNA三棱柱(DTP)的空间限制和CHA的信号放大功能,构建了一种分子内CHA组装体(intra-CHA3)用于MnSOD mRNA的灵敏检测。本设计通过DTP上的单链部分延伸出三对“DNA援手,借助“援手将3对相同的发卡组装到同一DTP上。MnSOD mRNA存在时会打开H,分离H上的Cy3和BHQ-2,导致Cy3荧光信号恢复。随后,H与邻近H反应并释放出MnSOD mRNA。基于DTP的空间限制,低浓度MnSOD mRNA在发生一次CHA循环释放后会进一步与同一DTP上其余的H反应,实现分子内CHA循环信号放大。实验结果表明,随着MnSOD mRNA浓度增加,Cy3的荧光信号也逐步增加,MnSOD mRNA浓度与荧光信号在0.05–10 nmol/L范围内有很好的线性关系,检测限为30 pmol/L。和游离CHA(free CHA)相比,检测限下降了30倍;与分子内含一对CHA的组装体(intra-CHA1)相比,检测限下降了8倍。以DTP作为载体,有利于发卡分子进入细胞并提高发卡的稳定性。将intra-CHA3用于细胞内MnSOD mRNA的成像,实验结果表明,正常细胞中MnSOD mRNA的表达明显低于肿瘤细胞,可实现正常细胞与肿瘤细胞的区分。同时也发现在STS诱导不同肿瘤细胞凋亡过程中,MnSOD mRNA的表达逐渐升高,充分证明了凋亡过程中上游信号分子MnSOD mRNA的表达上调,与文献报道结果一致。上述实验结果表明,将DTP的空间限制与分子内CHA循环信号放大相结合,可以实现MnSOD mRNA的灵敏检测及其在细胞凋亡过程中的成像分析,有望进一步用于细胞凋亡机制及凋亡途径等方面的研究。综上所述,本文以荧光成像为技术手段,利用Au NPs和DNA制备了响应迅速、稳定性高、生物相容性好的Au NPs-DNA球核酸纳米探针,实现了细胞凋亡过程中miR-630的实时监测。以DTP为载体,构建了分子内CHA的DNA纳米探针,结合CHA的信号放大功能和DTP的空间限制实现了MnSOD mRNA的灵敏检测,并将其应用于不同细胞内MnSOD mRNA的成像和细胞凋亡过程中MnSOD mRNA的实时成像分析。该研究拓展了DNA纳米探针在细胞凋亡相关分子检测及成像分析方面的应用,在凋亡过程分析、凋亡机制研究及药物疗效评价等方面显示出巨大的潜力。