三维DNA纳米探针用于活细胞内生物标志物的检测及动态成像

作     者：徐蜀妍 

作者单位：济南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘海云

授予年度：2022年

学科分类：0831[工学-生物医学工程（可授工学、理学、医学学位）] 081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 070302[理学-分析化学] 0703[理学-化学] 0836[工学-生物工程] 

主      题：DNA纳米结构 DNA三棱柱 DNA纳米探针 DNA比率探针 生物标志物检测 活细胞成像 

摘      要：DNA传统上被认为是生命系统中的核心遗传因子和生命的蓝图。由于其具有许多特殊的生物、物理、化学特征,各种形态的DNA结构开始被设计出来并作为一种功能材料在许多领域拓展出了具有重要意义的应用,尤其是在生物传感,分子诊断和分子治疗等领域。相比于无机纳米材料潜在的细胞毒性,DNA纳米材料具有天然的的生物相容性和结构稳定性,多碱基的构成意味着DNA纳米材料具备高可编程性和可修饰性的特点。除此之外,DNA纳米材料优越的细胞内化性能也已经被证实。因此DNA纳米材料显示出了作为活细胞递送载体的巨大潜力。首先,针对以往DNA三维结构仅用于细胞内或细胞表面物质及生物标志物检测的问题,借助核酸适配体的高亲和性和高灵敏性以及DNA三棱柱结构的细胞膜可穿透性的特点,设计了基于适配体的DNA三棱柱纳米探针（A-DTPNs）用于对细胞表面及细胞内两个位置的生物标志物进行两阶段动态检测及细胞分层成像。在有细胞膜上蛋白PTK7存在时,探针上修饰的适配体Sgc8c可与其特异性结合并通过链置换反应释放互补链与探针报告模块上修饰有荧光基团的DNA单链互补配对并释放其被淬灭基团淬灭的荧光信号从而实现探针第一阶段对细胞膜上生物标志物的识别并成像的目的。其后,借助DNA三棱柱结构优越的内化性能,使探针的剩余部分通过小窝蛋白的内吞作用进入细胞,实现探针上适配体P53对细胞质内p53蛋白的特异性识别及结合,从而使适配体P53的互补序列得到释放与报告模块中另一单链结合,恢复荧光基团的信号。另外,通过研究探针在不同细胞中获得的荧光图像对探针的特异性识别进行了验证,通过酶的消化和在不同生物系统中的荧光恢复情况探索了探针的稳定性。最后通过共聚焦显微镜荧光成像分析可以看出本研究中设计的（A-DTPNs）能够实现对细胞表面及细胞内部两位置的生物标志物进行分步识别和动态成像的目的,本研究对DNA纳米技术的应用,特别是在癌症标志物检测方面提供创新思路。其次,由于单发射的荧光探针是通过监测单个发射峰的强度来实现对目标物质的检测,这种方法很容易受到外界环境的影响产生较高的背景信号以及假阳性的实验结果。相比之下,比率荧光是通过记录两个不同位置的发射峰并计算其比值的方法来实现对目标物质的分析。这种方法能够有效降低外界环境的影响,可以避免由探针浓度,仪器灵敏度等问题所造成的影响,获得更加准确的实验结果。因此,在DNA三棱柱结构的基础上设计的一体化DNA三棱柱比率探针,可以实现对细胞表面及细胞内不同位置的一氧化氮合酶3的检测和成像。以DNA三棱柱为探针主体,连接两个比率型荧光探针作为报告模块,适配体AS411识别细胞膜表面蛋白并促进细胞内化使含有胆固醇的比率探针脱落并锚定在细胞膜上,通过NO敏感的二氨基罗丹明识别NO并计算其与参比荧光信号的比值作为膜上信号,随着DNA三棱柱结构的内化作用及适配体MUC1的靶向作用,剩余的探针进入细胞内并识别在高尔基体反向网络上的NO,产生第二个比率信号。由于二氨基罗丹明对NO的高敏感性,以及DNA三棱柱结构对细胞膜的高可渗透性和适配体的高亲和性,一体化DNA三棱柱比率探针表现出了出色的NO识别能力,成功实现对活细胞中一氧化氮合酶位置的成像。最后,本论文关于DNA三棱柱纳米探针对活细胞表面及细胞内物质的探索和研究为DNA纳米技术在癌症标志物及其他生物标志物的检测和成像提供了有效的方法和创新性的应用,在早期的临床诊断中具有广阔的应用前景并对癌症发现和治疗起到积极的作用。