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应用滚环扩增技术检测乙型肝炎病毒共价闭合环状dna的研究

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中华传染病杂志 2010年第9期28卷 513-518页

作者：赵旭刘红艳李新艳秦艳丽邬祥惠翁心华佘会元张继明复旦大学附属华山医院感染科上海200040 上海市第七人民医院感染科

目的应用滚环扩增（RCA）技术检测HBV共价闭合环状dna（cccdna）,观察该方法的特异性和敏感性.方法以HBV全基因质粒为模板,经酶切、连接、浓缩、胶回收纯化等步骤,构建和制备HBV cccdna标准品.抽提7例慢性乙型肝炎患者肝组织总dna,进... 详细信息

目的应用滚环扩增（RCA）技术检测HBV共价闭合环状dna（cccdna）,观察该方法的特异性和敏感性.方法以HBV全基因质粒为模板,经酶切、连接、浓缩、胶回收纯化等步骤,构建和制备HBV cccdna标准品.抽提7例慢性乙型肝炎患者肝组织总dna,进行滚环扩增.用HBV cccdna标准品、3.2 kb线性HBV dna、健康肝组织总dna及15例慢性乙型肝炎患者血清总dna作为对照,验证此方法的特异性.将HBV cccdna标准品进行系列稀释,了解该方法的敏感性.结果成功构建了HBV cccdna,并可用RCA方法进行扩增.RCA方法可从2 mg的慢性乙型肝炎患者肝组织中检测到HBV cccdna,并可检测低至1×102拷贝/μL的HBV ***方法不能检测3.2 kb线性HBV dna,在健康肝组织及15例慢性乙型肝炎患者血清中亦检测不到HBV cccdna.结论 RCA方法操作较方便,具有很高的特异性和敏感性.

关键词：肝炎病毒,乙型滚环扩增技术 dna,环状

乙型肝炎病毒共价闭合环状dna套式实时荧光定量聚合酶链反应的建立

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中华传染病杂志 2008年第8期26卷 458-462页

作者：陈延平王平忠白雪帆黄长形连建奇徐光华高峰孟存英第四军医大学唐都医院全军感染病诊疗中心西安710038 延安大学附属医院感染病科

目的建立检测HBV共价闭合环状dna（ceedna）的套式-实时荧光定量PCR法。方法根据HBVeecdna与松环dna（rcdna）结构上的差异，设计2对跨缺口的特异引物及1条位于负链缺121下游的特异TaqMan荧光探针。根据Plasmid—Safe^TM ATP—Dependent... 详细信息

目的建立检测HBV共价闭合环状dna（ceedna）的套式-实时荧光定量PCR法。方法根据HBVeecdna与松环dna（rcdna）结构上的差异，设计2对跨缺口的特异引物及1条位于负链缺121下游的特异TaqMan荧光探针。根据Plasmid—Safe^TM ATP—Dependent dnase（PSAD）对rcdna与ccedna作用的不同，对模板dna进行酶切纯化，降解rcdna，再进行套式PCR扩增，先用外引物和模板进行第一轮常规PCR，再用内引物、荧光探针和第一轮PCR产物进行实时荧光定量PCR，根据阳性参照标准品，得出待检标本定量值。结果检测阳性参照标准品，得出该方法灵敏度可达21g拷贝／mL。用上述方法检测34份乙型肝炎患者血清HBV dna阳性标本，25份血清HBV eccdna阳性，28份外周血单个核细胞HBV ccedna阳性。27份健康对照者血清HBV dna阴性标本，6份HBV cecdna阳性。对5份HBV cccdna阳性标本扩增产物进行克隆测序，无碱基缺失、突变。与HBV不同基因型序列（A～G）比较，同源性为90．6％～99．1％，其中，与B、C基因型同源性为95．3％～99．1％，验证了方法的特异度。结论套式一实时定量PCR法可检测乙型肝炎患者血清、PBMC中的HBV cccdna，且具有敏感、特异性。

关键词：肝炎病毒,乙型 dna,环状聚合酶链反应

肝功能正常的乙型肝炎病毒感染者肝组织共价闭合环状dna的研究

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中华传染病杂志 2013年第8期31卷 458-461页

作者：江军陈仕祥徐文胜熊志远何维新周燕赵克开陈玉缪晓辉范平解放军第一一三医院感染科宁波315040 上海长征医院感染科宁波315040 解放军第四〇四医院感染科宁波315040

目的探讨肝功能正常的HBV感染者肝组织HBV共价闭合环状dna（HBVcccdna）与血清HBVdna、肝组织总HBVdna之间的相关性。方法实时荧光定量PCR检测125例肝功能正常的HBV感染者的血清、肝组织总HBVdna和肝组织HBVcccdna定量。正态分布数据采... 详细信息

目的探讨肝功能正常的HBV感染者肝组织HBV共价闭合环状dna（HBVcccdna）与血清HBVdna、肝组织总HBVdna之间的相关性。方法实时荧光定量PCR检测125例肝功能正常的HBV感染者的血清、肝组织总HBVdna和肝组织HBVcccdna定量。正态分布数据采用直线相关分析，非正态分布数据采用非参数统计。结果HBV感染者血清HBVdna为（5．87±1．47）lgIU／mL，肝组织总HBVdna为（6．63±1．27）lg拷贝／l0-5细胞；HBVcccdna为（5．66±0．95）lg拷贝／l0-6细胞。血清HBVdna与肝组织总HBVdna呈正相关（r=0．743，P〈0．01），血清HBVdna与肝组织HBVcccdna呈正相关（r=0．417，P〈0．01），肝组织总HBVdna与肝组织HBVcccdna呈正相关（r=0．443，P〈0．01）。肝组织HBVcccdna在31～40岁年龄段最高，血清HBVdna和肝组织总HBVdna则在20～30岁年龄段最高。64例（51．2％）HBV感染者肝组织病理学提示为〈G2S2，HBVcccdna水平与肝组织炎症活动度分级和纤维化分期无关（X2=0．048，P〉0．05）。结论肝功能正常的HBV感染者肝组织HBVcccdna与肝内总HBVdna、血清HBVdna呈正相关，不同年龄HBV感染者血清和肝组织内HBV复制水平存在差异，HBVcccdna水平与肝组织病理学无关。

关键词：肝炎,乙型肝炎病毒,乙型 dna,环状 dna,病毒

乙型肝炎患者外周血单个核细胞中共价闭合环状dna的检测及其临床意义

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中华传染病杂志 2014年第4期32卷 214-218页

作者：朱圣涛谢琴秀张亚飞江晓平胡向阳柯晶李旭安徽医科大学第一附属医院感染病科合肥230032 安徽医科大学第一附属医院病理科合肥230032

目的分析HBV感染者PBMC中HBV cccdna与血清HBV dna、HBsAg、HBeAg、肝组织学的相关性,并探讨其临床意义.方法选取108例HBV感染者,密度梯度离心法提取PBMC,实时荧光定量PCR检测PBMC中HBV cccdna和血清HBV dna,化学发光定量检测血清中HB... 详细信息

目的分析HBV感染者PBMC中HBV cccdna与血清HBV dna、HBsAg、HBeAg、肝组织学的相关性,并探讨其临床意义.方法选取108例HBV感染者,密度梯度离心法提取PBMC,实时荧光定量PCR检测PBMC中HBV cccdna和血清HBV dna,化学发光定量检测血清中HBsAg和HBeAg,其中59例慢性HBV感染者行肝活组织检查.计数资料比较采用x2检验,计量资料比较采用相关性分析,计量资料不符合正态分布的采用非参数检验.结果 108例HBV感染者PBMC中HBV cccdna阳性59例,占54.6％,其中15例肝功能衰竭患者HBV cccdna阳性11例,明显高于8例急性乙型肝炎中2例阳性（x2 =4.960,P＜0.05）.根据患者血清HBV dna载量分为＞5 lg、3～5 lg和＜3 lg拷贝/mL组,其PBMC中HBV cccdna阳性率分别为76.1％（51/67）、5/18和13.0％（3/23）,HBV dna高载量组与中、低载量组比较,差异有统计学意义（x2值分别为14.751、28.384,均P＜0.05）.PBMC中HBVcccdna与血清HBV dna载量和HBsAg呈正相关（r值分别为0.554、0.497,均P＜0.05）.PBMC中HBV cccdna在肝组织学≥G2和（或）S2组检出率明显高于＜G2/S2组（x2=9.159,P＜0.05）.结论 HBV感染者PBMC中存在HBV cccdna,且与血清HBV dna和HBsAg呈正相关,也与肝组织学损伤相关.

关键词：肝炎,乙型,慢性肝炎病毒,乙型离心法,梯密度外周血单个核细胞 dna,环状

乙型肝炎患者血清中乙型肝炎病毒共价闭合环状dna的检测

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中华传染病杂志 2009年第8期27卷 473-477页

作者：赵克开王青缪晓辉徐文胜上海长征医院感染科 200003

目的检测不同肝脏病变程度的乙型肝炎患者外周血中的HBV共价闭合环状dna（HBVcccdna），评价其相关的影响因素和临床意义。方法共观察57例乙型肝炎患者，其中轻度慢性乙型肝炎患者26例，重型乙型肝炎患者31例。患者入院后行PT、肝功能... 详细信息

目的检测不同肝脏病变程度的乙型肝炎患者外周血中的HBV共价闭合环状dna（HBVcccdna），评价其相关的影响因素和临床意义。方法共观察57例乙型肝炎患者，其中轻度慢性乙型肝炎患者26例，重型乙型肝炎患者31例。患者入院后行PT、肝功能、肝炎病毒血清标志物等常规检测，并进行总HBVdna和HBVcccdna检测。Logistic逐步回归分析影响血清HBVcccdna检出率的相关因素。结果重型乙型肝炎组13份血清标本HBVcccdna为阳性，轻度慢性乙型肝炎组仅1份血清标本HBVcccdna为阳性，血清HBVcccdna的含量为1．25×10^3～4．88×10^4拷贝／mL，两组患者血清HBVcccdna检出率差异有统计学意义（P=0．0014）。血清HBVcccdna检测诊断重型乙型肝炎患者的灵敏度和特异度分别为41．94％和96．15％。***逐步回归分析显示，血清HBVcccdna的检出率与PT有关（χ^2=7．2192，P=0．0072），而与患者的年龄、性别、血清总HBVdna、TBil和ALT水平无相关性。结论部分乙型肝炎患者特别是重型肝炎患者外周血中可以检测出HBVcccdna，血清HBVcccdna的检出可作为支持重型乙型肝炎诊断的指标之一。

关键词：肝炎病毒,乙型 dna,环状肝功能衰竭

HBV共价闭合环状dna功能化纳米颗粒制备及鉴定

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福建医科大学学报 2016年第6期50卷 370-374页

作者：郭永灿王友强魏聪邓冲赵容邹霞涂植光西南医科大学附属中医医院检验科泸州646000 重庆医科大学检验医学院重庆400016

目的制备HBV共价闭合环状dna(cccdna)功能化磁性纳米颗粒,为进一步建立富集分离和检测cccdna方法奠定基础。方法通过亲和素修饰纳米颗粒表面,利用亲和素与生物素的亲和作用,将亲和素修饰的纳米颗粒与生物素标记的cccdna特异性探针偶联,... 详细信息

目的制备HBV共价闭合环状dna(cccdna)功能化磁性纳米颗粒,为进一步建立富集分离和检测cccdna方法奠定基础。方法通过亲和素修饰纳米颗粒表面,利用亲和素与生物素的亲和作用,将亲和素修饰的纳米颗粒与生物素标记的cccdna特异性探针偶联,制备cccdna功能化纳米颗粒,最后用cccdna探针完全互补的荧光标记序列与功能化纳米颗粒反应,鉴定其特性。结果亲和素修饰的纳米颗粒能结合生物素最大量为1 205ng/mg;通过与亲和素作用,生物素标记cccdna特异性探针固定在磁性纳米微粒表面,其最大结合生物素标记探针量为3.2×10^(-9) mol/mg;cccdna功能化纳米颗粒可捕获与其互补的荧光标记寡核苷酸序列,其最大捕获量为2.0×10^(-9) mol/mg,并能通过变性释放出保持生物学活性游离的荧光标记寡核苷酸序列。结论成功构建的cccdna功能化纳米微粒能有效捕获与其互补的序列,其捕获量能达到cccdna的分离提取要求。

关键词： *dna,病毒 dna,环状纳米粒子

干扰circ_0063865的表达影响食管鳞状细胞癌的恶性表型

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中华老年医学杂志 2023年第6期42卷 676-682页

作者：郑璇刘雪静崔逸爽田亚萍黄兰香刘维孙国贵华北理工大学公共卫生学院唐山063000 华北理工大学临床医学院唐山063000 华北理工大学河北省医工融合精准医疗重点实验室唐山063000

目的探讨circ_0063865在食管鳞状细胞癌(ESCC)组织和细胞中的表达及其对细胞生物学特性的影响。方法应用Sanger测序、背靠背引物验证以及核糖核酸外切酶(Ribonuclease R,RnaseR)耐受实验鉴定circ_0063865的环状结构及稳定性。RNA荧光原... 详细信息

目的探讨circ_0063865在食管鳞状细胞癌(ESCC)组织和细胞中的表达及其对细胞生物学特性的影响。方法应用Sanger测序、背靠背引物验证以及核糖核酸外切酶(Ribonuclease R,RnaseR)耐受实验鉴定circ_0063865的环状结构及稳定性。RNA荧光原位杂交实验检测ESCC病理组织芯片中circ_0063865的表达并分析其临床相关性。实时荧光定量聚合酶链反应(RTqPCR)检测正常食管上皮细胞系以及ESCC细胞系中circ_0063865的表达水平。Cell Counting Kit-8实验、集落形成实验、划痕实验、transwell侵袭实验以及流式细胞术分别检测circ_0063865对细胞增殖、迁移、侵袭能力以及凋亡水平的影响。结果Sanger测序、背靠背引物和RnaseR耐受实验验证了circ_0063865的成环性。RNA荧光原位杂交结果显示,circ_0063865在ESCC组织中表达的平均荧光强度显著高于其配对癌旁正常组织(t=2.267,P<0.05),circ_0063865表达与淋巴结转移显著相关(χ^(2)=4.356,P<0.05),circ_0063865高表达ESCC患者的平均总生存时间低于低表达患者。RT-qPCR结果表明,与正常食管上皮细胞系相比,circ_0063865在ESCC细胞系中的表达水平显著升高(F=18.413,P<0.05)。此外,敲低circ_0063865后,KYSE-30和KYSE-150细胞的增殖、迁移和侵袭能力显著降低,凋亡水平显著升高(均P<0.05)。结论ESCC中circ_0063865呈高表达,其表达变化与淋巴结转移显著相关,而且circ_0063865可促进ESCC细胞的增殖、迁移和侵袭。

关键词：食管肿瘤 dna,环状细胞增殖细胞凋亡

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乙型肝炎病毒共价闭合环状dna的研究进展

军医进修学院学报 2011年第2期32卷 199-200,F0003页

作者：艾志琼申元英大理学院公共卫生学院云南大理671000

共价闭合环状dna(Covalently Closed Circulardna,cccdna)是HBV dna在宿主细胞核内的存在形式,是HBV复制和转录的模板,长期存在于细胞核中,是HBV持续感染和抗病毒药物停用后病情反复的关键因素,对HBV的复制及感染状态的建立具有重要意... 详细信息

共价闭合环状dna(Covalently Closed Circulardna,cccdna)是HBV dna在宿主细胞核内的存在形式,是HBV复制和转录的模板,长期存在于细胞核中,是HBV持续感染和抗病毒药物停用后病情反复的关键因素,对HBV的复制及感染状态的建立具有重要意义。本文旨在对cccdna的合成调节、清除、检测意义等方面的研究进展作一综述。

关键词：共价闭合 dna,环状肝炎病毒,乙型

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环状RNA在肺动脉高压中的研究进展

安徽医药 2023年第12期27卷 2333-2338页

作者：黄殊伦唐昊吴艳无锡市人民医院、南京医科大学附属无锡人民医院呼吸与危重症医学科江苏无锡214000

环状RNA是一种稳定、保守的凭借共价键首尾相连的闭合环状RNA,研究表明环状RNA和多种疾病的发生发展密切相关。肺动脉高压(PH)是一类以肺血管阻力进行性升高为特征的肺血管疾病,其发病机制尚不明确。近年来越来越多的研究提示环状RNA在P... 详细信息

环状RNA是一种稳定、保守的凭借共价键首尾相连的闭合环状RNA,研究表明环状RNA和多种疾病的发生发展密切相关。肺动脉高压(PH)是一类以肺血管阻力进行性升高为特征的肺血管疾病,其发病机制尚不明确。近年来越来越多的研究提示环状RNA在PH的发生发展中可能扮演重要角色,为PH的诊断和治疗提供新线索。该文结合环状RNA在PH领域的研究现状,综述其在PH中的作用和机制。

关键词： dna,环状肺动脉高压肺动脉平滑肌细胞肺动脉内皮细胞细胞焦亡