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赤霉素调控豆科植物结瘤固氮相关重要蛋白DELLA与GID1的纯化工艺...

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作者：彭凯华中农业大学

学位级别：硕士

豆科植物-根瘤菌共生固氮是一种高效的生物固氮体系,解析根瘤共生固氮的分子调控机制,不仅具有重要的科学意义,也是人类促成农业可持续发展的重要保障,相关领域一直是研究热点。植物在生长发育过程中受多种环境因子和激素的调控,其中关... 详细信息

豆科植物-根瘤菌共生固氮是一种高效的生物固氮体系,解析根瘤共生固氮的分子调控机制,不仅具有重要的科学意义,也是人类促成农业可持续发展的重要保障,相关领域一直是研究热点。植物在生长发育过程中受多种环境因子和激素的调控,其中关键转录调控子DELLA蛋白可受赤霉素(Gibberellin,GA)调控影响根瘤菌的形成从而影响固氮效率。目前已报道DELLA蛋白的活性依赖赤霉素信号通路调控,在受体GID1结合GA后,DELLA蛋白与GA-GID1紧密结合,进一步与GID2结合被泛素化降解,从而调控植物生长发育。目前对于DELLA蛋白的功能研究较多,但是相关结构研究却知之甚少,GA介导的DELLA与GID1及GID2的相互作用机制还不清晰,因此解析包含GA,GID1与DELLA全长复合物蛋白的结构是十分必要的。本课题的研究目的是为后续开展复合物的结构研究提供优质的蛋白质机器材料,未来在此基础上,可结合有关生化实验进一步全面阐述清楚DELLA特异性参与GAs信号转导。若能解析它的组装机制以及发挥活性调控机制,继而对复合物活性改造,为培育固氮高效植株,实现作物高产和发展绿色农业奠定理论基础。课题已取得以下成果:利用大肠杆菌表达体系重组表达了目的蛋白,并通过共纯化﹑共表达﹑共孵育的策略成功获取高纯度GA-GID1-DELLA的复合物,其中共表达的策略最经济高效,同等菌量20g,共表达方式获取复合物最多,达到5mg,所需时间短,耗时4天;通过丝氨酸蛋白酶解寻找蛋白不稳定区域氨基酸并突变,以及蛋白质表面Cys突变成Ser进行蛋白的改造和状态优化,进一步获取状态较稳定的复合物蛋白,并进行大量结晶筛选尝试;最终,通过冷冻电镜技术手段,我们成功收取了一套7?左右复合物冷冻电镜数据,初步分析并验证DELLA与GID1存在两个区域的互作,DELLA蛋白的C端区域也参与GID1-DELLA的互作。未来需要继续对复合物蛋白进行优化,提高分辨率,进而为后续结构研究提供更多数据支持。

关键词：共生固氮 GA信号通路 DELLA 结构解析

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参薯DELLA基因家族鉴定及分析

分子植物育种 2023年第13期21卷 4202-4208页

作者：吴晓龙梅朋飞庄赛伟陶相如黄东益黄小龙吴文嫱夏薇海南大学热带作物学院海口570228 海南大学生命科学学院海口570228

DELLA基因家族是参与赤霉素信号调节过程的负调控因子,DELLA常与其他转录因子结合,通过影响这些转录因子起作用。为了解析参薯中DELLA基因家族的调控网络,本研究对参薯DELLA基因家族进行鉴定,对其理化性质、系统进化树、保守基序、亚细... 详细信息

DELLA基因家族是参与赤霉素信号调节过程的负调控因子,DELLA常与其他转录因子结合,通过影响这些转录因子起作用。为了解析参薯中DELLA基因家族的调控网络,本研究对参薯DELLA基因家族进行鉴定,对其理化性质、系统进化树、保守基序、亚细胞定位预测,赤霉素处理后基因转录谱、互作转录因子进行分析。研究发现,参薯DELLA基因家族包含4个家族成员,都为酸性蛋白。系统进化树分析发现DaDELLA2与拟南DELLA基因处于同一分支,保守基序分析发现除DaDELLA4外,都含有10个蛋白保守序列,DaDELLA定位主要分布在细胞质和细胞核中。根据转录谱发现,赤霉素处理15 d和60 d后,转录因子DaAP2.7-LG16在块茎中表达量最高。分子实验表明DaDELLA2自激活发生在DELLA蛋白N端,与DaAP2.7-LG16存在互作,且互作用主要发生在DELLA蛋白的N端。以上研究对参薯DELLA蛋白基因家族进行初步分析,为进一步的研究提供基础。

关键词： DELLA 参薯基因家族酵母双杂

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大豆DELLA基因单倍型与花期关联分析及基因编辑靶点鉴定

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植物遗传资源学报 2022年第3期23卷 787-799页

作者：贺米兰李海洋黄泽荣孔凡江赵晓晖广州大学生命科学学院广州510006

DELLA蛋白作为赤霉素负调控因子参与植物开花期调控。与拟南芥DELLA蛋白同源比对,研究发现大豆具有8个DELLA基因,其中GmGAI3a只有GRAS结构域,其他7个DELLA蛋白均具有DELLA结构域和GRAS结构域。对8个大豆DELLA基因在424份材料的自然群体... 详细信息

DELLA蛋白作为赤霉素负调控因子参与植物开花期调控。与拟南芥DELLA蛋白同源比对,研究发现大豆具有8个DELLA基因,其中GmGAI3a只有GRAS结构域,其他7个DELLA蛋白均具有DELLA结构域和GRAS结构域。对8个大豆DELLA基因在424份材料的自然群体中的单倍型与开花期进行关联分析,发现DELLA基因早花型自然变异已经应用于我国中高纬度地区,推测大豆DELLA基因负向调控开花。利用CRISPR/Cas9技术,在大豆发根系统中验证靶点的编辑效率,成功鉴定出7个DELLA基因的有效靶点,为进一步获得稳定遗传转化的大豆DELLA突变体及解析基因功能提供了重要的靶点信息与理论基础。

关键词：大豆 DELLA 单倍型花期关联分析 CRISPR/Cas9

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Retrotransposon-mediated DELLA transcriptional reprograming underlies semi-dominant dwarfism in foxtail millet

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The Crop Journal 2019年第4期7卷 458-468页

作者： Meicheng Zhao Hui Zhi Xue Zhang Guanqing Jia Xianmin Diao Institute of Crop Sciences Chinese Academy of Agricultural Sciences Beijing 100081 China Center for Agricultural Research Resources Institute of Genetics and Developmental Biology Chinese Academy of Sciences Shijiazhuang 050021 Hebei China

Retrotransposons account for a large proportion of the genome and genomic variation, and play key roles in creating novel genes and diversifying the genome in many eukaryotic species. Although retrotransposons are abundant in plants, their roles had been underestimated because of a lack of research. Here, we characterized a gibberellin Acid (GA)-insensitive dwarf mutant, 84133, in foxtail millet. Map-based cloning revealed a 5.5-kb Copia-like retrotransposon insertion in DWARF1 (D1), which encodes a DELLA protein. Transcriptional analysis showed that the Copia retrotransposon mediated the transcriptional reprogramming of D1 leading to a novel N-terminal-deleted truncated DELLA transcript that was putatively driven by Copia's LTR, namely D1-TT, and another chimeric transcript. The presence of D1-TT was confirmed by protein immunodetection analysis. Furthermore, D1-TT protein was resistant to GA3 treatment compared with the intact DELLA protein due to its inability to interact with the GA receptor, SiGID1. Overexpression of D1-TT in foxtail millet resulted in dwarf plants, confirming that it determines the dwarfism of 84133. Thus, our study documents a rare instance of long terminal repeat (LTR) retrotransposon-mediated transcriptional reprograming in the plant kingdom. These results shed light on the function of LTR retrotransposons in generating new gene functions and genetic diversity.

关键词： Retrotransposon Transcriptional reprogramming DELLA Dwarf breeding Foxtail millet (Setaria italica)

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Arabidopsis DET1 Represses Photomorphogenesis in Part by Negatively Regulating DELLA Protein Abundance in Darkness

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Molecular Plant 2015年第4期8卷 622-630页

作者： Kunlun Li Zhaoxu Gao Hang He William Terzaghi Liu-Min Fan Xing Wang Deng Haodong Chen Peking-Yale Joint Center for Plant Molecular Genetics and Agro-biotechnology State Key Laboratory of Protein and Plant Gene Research Peking -Tsinghua Center for Life Sciences College of Life Sciences Peking University Beijing 100871 China Department of Biology Wilkes University Wilkes-Barre PA 18766 USA Department of Molecular Cellular and Developmental Biology Yale University New Haven CT 06520-8104 USA

Arabidopsis De-etiolated 1 （DET1） is one of the key repressors that maintain the etiolated state of seedlings in darkness. The plant hormone gibberellic acid （GA） also participates in this process, and plants deficient in GA synthesis or signaling show a partially de.etiolated phenotype in darkness. However, how DET1 and the GA pathway work in concert in repressing photomorphogenesis remains largely unknown. In this study, we found that the abundance of DELLA proteins in detl-1 was increased in comparison with that in the wildtype plants. Mutation in DET1 changed the sensitivity of hypocotyl elongation of mutant seedlings to GA and paclobutrazol （PAC）, an inhibitor of GA synthesis. However, we did not find obvious differences between detl-1 and wild-type plants with regard to the bioactive GA content or the GA signaling upstream of DELLAs. Genetic data showed that removal of several DELLA proteins suppressed the detl-1 mutant phenotype more obviously than GA treatment, indicating that DET1 can regulate DELLA proteins via some other mechanisms. In addition, a large-scale transcriptomic analysis revealed that DET1 and DELLAs play antagonistic roles in regulating expression of photosynthetic and cell elongation-related genes in etiolated seedlings. Taken together, our results show that DET1 represses photomorphogenesis in darkness in part by reducing the abundance of DELLA proteins.

关键词： DET1 DELLA gibbereltic acid （GA） photomorphogenesis Arabidopsis

The DELLA-ABI4-HY5 module integrates light and gibberellin signals to regulate hypocotyl elongation

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Plant Communications 2023年第5期4卷 223-233页

作者： Haibo Xiong Dandan Lu Zhiyuan Li Jianghao Wu Xin Ning Weijun Lin Zechen Bai Canhui Zheng Yang Sun Wei Chi Lixin Zhang Xiumei Xu State Key Laboratory of Crop Stress Adaptation and Improvement School of Life SciencesHenan UniversityJinming AvenueKaifeng 475004China Sanya Institute of Henan University Sanya 572025China Photosynthesis Research Center Key Laboratory of PhotobiologyInstitute of BotanyChinese Academy of SciencesNanxincun 20XiangshanBeijing 100093China Shenzhen Institute of Advanced Technology Chinese Academy of SciencesShenzhen 518055China

Plant growth is coordinately controlled by various environmental and hormonal signals,of which light and gibberellin(GA)signals are two critical factors with opposite effects on hypocotyl elongation.Although interactions between the light and GA signaling pathways have been studied extensively,the detailed regulatory mechanism of their direct crosstalk in hypocotyl elongation remains to be fully clarified.Previously,we reported that ABA INSENSITIVE 4(ABI4)controls hypocotyl elongation through its regulation of cellelongation-related genes,but whether it is also involved in GA signaling to promote hypocotyl elongation is unknown.In this study,we showthat promotion of hypocotyl elongation by GA is dependent on ABI4 activation.DELLAs interact directly with ABI4 and inhibit its DNA-binding activity.In turn,ABI4 combined with ELONGATED HYPOCOTYL 5(HY5),a key positive factor in light signaling,feedback regulates the expression of the GA2ox GA catabolism genes and thus modulates GA levels.Taken together,our results suggest that the DELLA-ABI4-HY5 module may serve as a molecular link that integrates GA and light signals to control hypocotyl elongation.

关键词： light signal GA signal hypocotyl elongation DELLA ABI4 HY5

葡萄全基因组DELLA蛋白基因家族鉴定及其应答外源赤霉素调控葡萄果实发育的特征

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中国农业科学 2018年第16期51卷 3130-3146页

作者：张文颖王晨朱旭东马超王文然冷翔鹏郑婷房经贵南京农业大学园艺学院上海交通大学农业与生物学院青岛农业大学园艺学院

【目的】明确DELLA蛋白基因在葡萄基因组数据库中的数量、结构和组织表达差异,探究DELLA蛋白在葡萄赤霉素(GA)信号传导及葡萄无核果实发育机理中的作用机制。【方法】基于拟南芥、水稻等植物中的DELLA蛋白基因,利用HMMER程序和NCBI的CD... 详细信息

【目的】明确DELLA蛋白基因在葡萄基因组数据库中的数量、结构和组织表达差异,探究DELLA蛋白在葡萄赤霉素(GA)信号传导及葡萄无核果实发育机理中的作用机制。【方法】基于拟南芥、水稻等植物中的DELLA蛋白基因,利用HMMER程序和NCBI的CDD程序鉴定葡萄基因组中的DELLA蛋白基因;以‘白罗莎里奥’葡萄品种为试材,采用PCR技术克隆3个DELLA蛋白基因的c DNA全长序列;通过启动子作用元件分析预测其潜在功能;利用生物信息学软件对其染色体定位、基因结构、系统进化、理化特性、亚细胞定位及蛋白互作等进行分析;利用农杆菌介导的烟草瞬时表达技术分析DELLA蛋白的亚细胞定位情况;采用q RT-PCR方法检测葡萄DELLA蛋白基因应答GA在果皮、果肉、种子(或种子区)的时空表达特征。【结果】鉴定得到3个葡萄DELLA蛋白基因,克隆并验证其精确序列,分别命名为Vv GAI1(VIT201s0011g05260)、Vv RGA(VIT214s0006g00640)及Vv SLR1(VIT211s0016g04630),其染色体定位、开放阅读框(ORF)大小、编码氨基酸数量分别为:Chr1、1 773 bp、590个;Chr14、1 710 bp、569个;Chr11、1 599 bp、532个。基因结构分析表明其DNA序列均无内含子,只有1个外显子,基因结构高度保守。进化分析显示Vv GAI1与Vv RGA亲缘关系较近,被聚类为一组,而Vv SLR1为另一组。3个基因的启动子均含有响应赤霉素和胚乳发育相关的作用元件,表明它们可能参与响应GA信号传导和胚乳发育过程。亚细胞定位结果显示3个DELLA蛋白均定位于细胞核。q RT-PCR结果显示除果皮中Vv SLR1在近成熟期具有表达高峰外,其余均在幼果期高表达,且外源GA处理均不同程度降低了3个DELLA蛋白基因在葡萄果皮、果肉和种子区的表达,尤以种子区下调水平最为显著。蛋白互作分析表明3个DELLA蛋白均为葡萄GA信号传导的核心作用元件,均可能与GIDI1和SLY1互作参与葡萄GA信号传导。【结论】葡萄基因组中含有3个DELLA蛋白基因家族成员;不同物种间DELLA蛋白结构高度保守;GA可能通过负调控这3个成员参与葡萄果皮、果肉和种子区的发育,且3个成员均可能通过应答GA信号调控葡萄无核果实的发育。

关键词：葡萄 DELLA 亚细胞定位表达互作赤霉素

DELLA Proteins Promote Anthocyanin Biosynthesis via Sequestering MYBL2 and JAZ Suppressors of the MYB/bHLH/WD40 Complex in Arabidopsis thaliana

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Molecular Plant 2016年第5期9卷 711-721页

作者： Ye Xie Huijuan Tan Zhaoxue Ma Jirong Huang National Key Laboratory of Plant Molecular Genetics CAS Center for Excellence in Molecular Plant Sciences Institute of Plant Physiology and EcologyShanghai Institutes for Biological Sciences Chinese Academy of Sciences Shanghai 200032 China University of the Chinese Academy of Sciences Beijing 100049 China

Anthocyanin accumulation is recognized as a visible biomarker of plants that have suffered from environmental stresses. However, the molecular mechanisms underlying stress-induced anthocyanin biosynthesis remain unclear. Expression of anthocyanin-specific genes is regulated by the conserved MBW complex, which is composed of the MYB, bHLH, and WD40 subunRs in higher plants. MBW activity is repressed by MYBL2 and the JAZ family proteins, which bind competitively to bHLH and MYB/bHLH, respectively. Here, we found that MYBL2 and JAZs mediate gibberellic acid-inhibRed anthocyanin biosynthesis in Arabidopsis. Competitive pull-down and dual-lucifarase assays showed that DELLA proteins directly sequester MYBL2 and JAZ repressors, leading to the release of bHLH/MYB subunits and subsequently to the formation of active MBW complex, which then activates the anthocyanin biosynthetic pathway. The JAZ-DELLA-MYBL2 module also plays an Important role in abiotic stress-induced anthocy- anin biosynthesis. Furthermore, we found that the DELLA protein RGA accumulates upon plant exposure to abiotic stresses. Altogether, our data reveal that DELLA-promoted anthocyanin biosynthesis is mediated at least in part by MYBL2 and JAZ regulatory proteins, providing new insights into the coordinated regulation of plant growth and defense through metabolic pathway regulation.

关键词： DELLA MYBL2 JAZ anthocyanin biosynthesis abiotic stresses

DELLA蛋白CbuGRAS9调控楸树开花功能的初步研究

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DELLA蛋白CbuGRAS9调控楸树开花功能的初步研究

作者：王珊珊东北林业大学

学位级别：硕士

成花转变是植物生活史上的复杂过程,是由营养生长到生殖生长的关键发育过程。赤霉素途径是开花的主要调控途径之一,一些参与赤霉素信号转导的转录因子已经被鉴定出来,其中DELLA蛋白是赤霉素途径中的关键蛋白,对林木的成花转变具有重要... 详细信息

成花转变是植物生活史上的复杂过程,是由营养生长到生殖生长的关键发育过程。赤霉素途径是开花的主要调控途径之一,一些参与赤霉素信号转导的转录因子已经被鉴定出来,其中DELLA蛋白是赤霉素途径中的关键蛋白,对林木的成花转变具有重要的调控作用。在成花转变过程中,DELLA蛋白会抑制一系列花芽诱导基因的表达,从而实现对林木的开花的调控。探究楸树(Catalpa bungei)DELLA蛋白的功能有助于进一步揭示木本植物的开花调控机制。本研究以百日花楸树为研究对象,通过比对拟南芥(Arabidopsis thaliana)中的DELLA基因,筛选到5个楸树DELLA基因同源基因,并对其进行了表达模式和生物学功能的初步研究,对DELLA蛋白在百日花楸树成花转变过程中的功能进行初步验证,主要结果如下:(1)利用比较基因组学,在楸树基因组中鉴定出了5个拟南芥DELLA基因的同源基因。通过生物信息学分析表明,这5个DELLA蛋白均含有DELLA和GRAS保守结构域;5个楸树DELLA基因的组织特异性表达分析结果显示,DELLA基因主要在楸树的顶芽和幼叶中表达,在其他部位表达量相对较低。除了Cbu GRAS2之外,DELLA基因在百日花楸树中的表达量整体高于在9-1楸树中的表达量,表达量相差最大的DELLA基因是Cbu GRAS9。(2)亚细胞定位实验结果显示Cbu GRAS9-GFP的绿色荧光信号在细胞核内,表明楸树的Cbu GRAS9蛋白定位于细胞核。(3)在拟南芥中过量表达Cbu GRAS9后进行表型观察,相比于野生型拟南芥,转基因植株表现出莲座叶数增多、开花时间推迟和株高变矮等表型。结果表明Cbu GRAS9基因参与调控拟南芥的莲座叶数量、开花时间和株高。(4)通过酵母双杂交筛库实验,对筛选到的阳性克隆扩增产物进行高通量测序,结果筛选到了2392个基因,其中有转录因子104个。为了进一步探索筛选到的2392个基因的功能,对这些基因进行GO和KEGG富集分析。GO分析结果显示,在生物过程层面,代谢过程、细胞过程和单物种过程这3个条目显著富集;在细胞组成层面,细胞和细胞组分两个条目显著富集;在分子功能层面,绑定和催化活性两个条目显著富集。在KEGG富集分析中,基因富集的通路主要在代谢通路和次生代谢物合成通路。根据GO和KEGG分析结果表明,通过筛库得到的基因可能与代谢相关。

关键词：楸树提前开花赤霉素 DELLA 亚细胞定位酵母文库筛选