赤霉素调控豆科植物结瘤固氮相关重要蛋白DELLA与GID1的纯化工艺优化及改造初探

作     者：彭凯 

作者单位：华中农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：徐曙彤

授予年度：2023年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 071007[理学-遗传学] 

主      题：共生固氮 GA信号通路 DELLA 结构解析 

摘      要：豆科植物-根瘤菌共生固氮是一种高效的生物固氮体系,解析根瘤共生固氮的分子调控机制,不仅具有重要的科学意义,也是人类促成农业可持续发展的重要保障,相关领域一直是研究热点。植物在生长发育过程中受多种环境因子和激素的调控,其中关键转录调控子DELLA蛋白可受赤霉素(Gibberellin,GA)调控影响根瘤菌的形成从而影响固氮效率。目前已报道DELLA蛋白的活性依赖赤霉素信号通路调控,在受体GID1结合GA后,DELLA蛋白与GA-GID1紧密结合,进一步与GID2结合被泛素化降解,从而调控植物生长发育。目前对于DELLA蛋白的功能研究较多,但是相关结构研究却知之甚少,GA介导的DELLA与GID1及GID2的相互作用机制还不清晰,因此解析包含GA,GID1与DELLA全长复合物蛋白的结构是十分必要的。本课题的研究目的是为后续开展复合物的结构研究提供优质的蛋白质机器材料,未来在此基础上,可结合有关生化实验进一步全面阐述清楚DELLA特异性参与GAs信号转导。若能解析它的组装机制以及发挥活性调控机制,继而对复合物活性改造,为培育固氮高效植株,实现作物高产和发展绿色农业奠定理论基础。课题已取得以下成果:利用大肠杆菌表达体系重组表达了目的蛋白,并通过共纯化﹑共表达﹑共孵育的策略成功获取高纯度GA-GID1-DELLA的复合物,其中共表达的策略最经济高效,同等菌量20g,共表达方式获取复合物最多,达到5mg,所需时间短,耗时4天;通过丝氨酸蛋白酶解寻找蛋白不稳定区域氨基酸并突变,以及蛋白质表面Cys突变成Ser进行蛋白的改造和状态优化,进一步获取状态较稳定的复合物蛋白,并进行大量结晶筛选尝试;最终,通过冷冻电镜技术手段,我们成功收取了一套7?左右复合物冷冻电镜数据,初步分析并验证DELLA与GID1存在两个区域的互作,DELLA蛋白的C端区域也参与GID1-DELLA的互作。未来需要继续对复合物蛋白进行优化,提高分辨率,进而为后续结构研究提供更多数据支持。