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先天性遗传性核性白内障家系致病基因GJA8突变型和野生型在真核细胞中的蛋白表达

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中华医学杂志 2010年第15期90卷 1062-1066页

作者：郑建秋刘平王建文刘建巨哈尔滨医科大学附属第一医院眼科医院 150001

目的克隆一个先天性遗传性核性白内障家系致病基因GJA8，研究该基因野生型（wGJA8）和突变型（mGJA8）在体外真核细胞系中的表达。方法以正常人类和家系患者基因组DNA为模板进行PCR扩增，分别调取wGJA8和mGJA8。构建质粒pEGFP—N1-WGJA8... 详细信息

目的克隆一个先天性遗传性核性白内障家系致病基因GJA8，研究该基因野生型（wGJA8）和突变型（mGJA8）在体外真核细胞系中的表达。方法以正常人类和家系患者基因组DNA为模板进行PCR扩增，分别调取wGJA8和mGJA8。构建质粒pEGFP—N1-WGJA8和pEGFP-N1-mGJA8，经双酶切测序鉴定后分别转染COS7细胞，用荧光显微镜观察蛋白表达情况，Western印迹和免疫组化法检测蛋白表达。结果目的基因wGJA8和mGJA8克隆成功，经双酶切和DNA测序证实质粒pEGFP．N1-wGJA8和pEGFP—N1-mGJA8构建成功。荧光显微镜观察到野生型蛋白和突变型蛋白在体外培养的COS7细胞内均有表达，Western印迹和免疫组化显示基因wGJA8和mGJA8在COS7细胞中均有蛋白表达。结论成功克隆出该家系致病基因wGJA8和mGJA8，完成了致病基因在真核细胞中的蛋白表达，为进一步研究该家系白内障的确切发病机制奠定了基础。

关键词：先天性遗传性白内障 GJA8 突变型 Cx50

Connexin突变导致先天性白内障的遗传学及功能分析

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Connexin突变导致先天性白内障的遗传学及功能分析

作者：周政河南大学

学位级别：硕士

背景白内障是由于晶状体浑浊,透光度降低引起的视力障碍,是人类致盲的主要原因之一。根据白内障发生时期不同可以将白内障分为先天性白内障和老年性白内障。而先天性白内障是儿童致盲的常见原因,先天性白内障多余多基因突变有关,根据致... 详细信息

背景白内障是由于晶状体浑浊,透光度降低引起的视力障碍,是人类致盲的主要原因之一。根据白内障发生时期不同可以将白内障分为先天性白内障和老年性白内障。而先天性白内障是儿童致盲的常见原因,先天性白内障多余多基因突变有关,根据致病基因的功能不同可以大致分为六大类:晶状体蛋白基因、间隙连接蛋白基因、发育调控因子基因、细胞骨架蛋白基因、酪氨酸激酶受体基因和染色质修复蛋白基因。间隙连接蛋白作为重要的细胞膜蛋白,是组成细胞间间隙连接通道的重要亚基,具有介导细胞之间生物小分子的转运功能,例如:代谢产物、离子和第二信使等。间隙连接在维持细胞稳态与晶状体分化及其稳态的过程中发挥着重要作用。在人类晶状体中组成间隙连接通道的亚基根据分子量不同可以分为:cx43、cx46和Cx50,它们分别由基因:GJA1、GJA3和GJA8基因编码。研究表明,GJA3和GJA8功能异常导致先天性白内障的发生。目前,已经发现超过20个GJA3基因突变和23个GJA8基因突变与人类先天性白内障相关,而GJA3或者GJA8基因的突变可能会导致其编码的Connexin的结构、功能等发生改变,继而影响细胞间间隙连接通道功能异常,最终诱发白内障。但是,间隙连接蛋白基因突变导致先天性白内障的具体分子机制并不完全清楚。目的1.鉴定两个常染色体显性遗传的先天性白内障家系的致病基因。2.初步探究GJA3和GJA8基因突变导致两个家系发生先天性白内障的分子机制。方法1.伦理授权在对白内障家系研究之前,我们向河南大学伦理委员会和开封中心医院伦理员会提交针对临床标本进行研究申请,并通过伦理委员会的审核。2.临床诊断与家系分析我们与开封市眼科医院合作收集到白内障家系,在取得家系成员知情同意的情况下,由专业眼科医生对家系成员进行详细的眼科检查(视力检查、裂隙灯检查)和相关病史的调查。通过绘制家系图谱初步确定家系患有的白内障的遗传方式。3.全血基因组DNA提取以及候选基因筛查及鉴定在确定家系患有的白内障并非其他疾病的并发症之后,我们抽取家系成员的外周血,随后抽提外周血基因组DNA,并利用PCR将11对候选基因(cryaa,cryab,crybb1,cybb2,crygc,crygd,GJA3,GJA8,Hsf4,Mip,Pitx3)进行扩增,将PCR产物进行外显子测序(金唯智公司)和基因序列分析,初步确定致病基因。4.利用免疫印迹法测定野生和突变间隙连接蛋白在病人晶状体组织中的表达量收集家系成员白内障手术中获取的晶状体前囊上皮组织,利用蛋白免疫印迹法检测家系中白内障患者与对照组老年性白内障病人晶状体中间隙连接蛋白的表达量。5.免疫荧光技术测定间隙连接蛋白亚细胞定位方式以及Cx50在小鼠晶状体的表达和分布情况构建表达GFP-WT-Cx50、GFP-Insert-Cx50,将质粒转染HLE细胞,利用免疫荧光技术观察Cx50在细胞中的定位方式。Cx50在小鼠晶状体组织内的表达量和分布为了检测Cx50在小鼠晶状体中的分布情况,选取不同周龄(年龄)的小鼠,取其晶状体进行石蜡切片。随后进行免疫荧光染色,通过激光共聚焦显微镜观察Cx50在小鼠晶状体中的分布情况。6.间隙连接蛋白的半通道功能检测将 GFP-WT-Cx50、GFP-Insert-Cx50 质粒瞬时转染入 HLE,利用 dye uptake assay 检测PI染料通过野生型Cx50与突变型Cx50的能力,以此说明间隙连接蛋白的半通道功能是否发生异常。7.MTT实验测定突变型间隙连接蛋白对细胞增殖能力影响将GFP-WT-Cx50、GFP-Insert-Cx50质粒瞬时转染HLE细胞,利用MTT法,检测HLE细胞的增殖速度,以此说明突变型Cx50对细胞增殖能力的影响。结果1.cx46移码突变与一个家族显性遗传性白内障发生相关。应用遗传图谱分析技术,我们对一个患有先天白内障的家系进行分析,确定该家系为家族显性遗传性白内障家系。提取家系内正常人,先证和其他患者外周血的DNA,通过PCR扩增11对先天性白内障候选基因的外显子,并进行测序。结果显示,先证者GJA3基因cDNA的1195位点后插入碱基C(c.1194195ins C),导致cx46 C末端400位氨基酸后发生移码突变(cx46fs400),并且该突变在该家系里共分离。为了探究cx46fs400对cx46蛋白的影响,我们利用生物信息学对cx46蛋白的生化性质进行预测。结果发现,该突变可能会引起cx46的疏水性增加,同时可能会引起cx46的二级结构发生改变。为了确定该突变是否会影响cx46在病人晶状体中的蛋白稳定性,我们检测了该家系中先证者的晶状体组织中cx46的表达水平。结果显示,cx46fs400导致cx46表达水平显著降低(CuiX K,Zhu K K,Zhou Z,et al.A novel frameshift mutation in cx46 associated with here

关键词：先天性白内障 cx 46 Cx50 基因突变膜定位半通道功能损伤

母子共患KID综合征患者皮损中连接蛋白的检测及分析

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皮肤性病诊疗学杂志 2019年第5期26卷 267-270页

作者：柳莉丹姜亚楠刘家蕊陈永锋南方医科大学皮肤病医院广东广州510091 深圳市人民医院广东深圳518020 河南科技大学第二附属医院河南洛阳471002

目的:探讨KID综合征患者皮损中连接蛋白cx31、cx43、Cx50表达与KID综合征发病的相关性。方法:选择一家系中母子共患KID综合征患者作为病例组,采用免疫组化检测皮损中连接蛋白cx31、cx43、Cx50的表达,并以该家系中1例正常成员及我院1例... 详细信息

目的:探讨KID综合征患者皮损中连接蛋白cx31、cx43、Cx50表达与KID综合征发病的相关性。方法:选择一家系中母子共患KID综合征患者作为病例组,采用免疫组化检测皮损中连接蛋白cx31、cx43、Cx50的表达,并以该家系中1例正常成员及我院1例美容门诊手术正常人作为对照进行比较分析。结果:病例组cx31均在表皮棘层和基底层表达,而对照组2例均在表皮基底层表达,病例组cx31表达水平上调。cx43、Cx50在病例组及对照组皮肤中分布一致,表达水平无明显变化。结论:KID综合征患者皮损中cx31表达水平上调,cx43、Cx50表达水平变化不明显,三者是否参与KID综合征的发病有待进一步研究。

关键词： KID综合征 cx31 cx43 Cx50

Cx50 V64G突变的生物信息学分析及其真核表达载体的构建(英文)

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国际眼科杂志 2007年第5期7卷 1206-1208页

作者：刘平林英杨悦莹郑建秋侯影金迪付小玻马洪梅哈尔滨医科大学附属第一临床医学院附属眼科医院眼三科中国黑龙江省哈尔滨市150001 哈尔滨医科大学生物信息学院中国黑龙江省哈尔滨市150086

目的:构建pcDNA3.1/Cx50 V64G真核表达载体,用生物信息学软件分析V64G突变对人缝隙连接蛋白Cx50的影响。方法:经PCR获得Cx50基因片段,重组至真核表达载体pcDNA3.1/Amp(+)中,经PCR,酶切和序列测定方法鉴定重组质粒。结果:获得了具有V64G... 详细信息

目的:构建pcDNA3.1/Cx50 V64G真核表达载体,用生物信息学软件分析V64G突变对人缝隙连接蛋白Cx50的影响。方法:经PCR获得Cx50基因片段,重组至真核表达载体pcDNA3.1/Amp(+)中,经PCR,酶切和序列测定方法鉴定重组质粒。结果:获得了具有V64G突变的Cx50的编码基因,并成功构建了其真核表达载体。并证明64位缬氨酸在不同物种的Cx50及在人的多种缝隙连接蛋白是高度保守的区域,与白内障的发生高度相关。结论:pcDNA3.1/Cx50 V64G真核表达质粒的成功构建和鉴定为进一步研究白内障机理奠定了基础。

关键词： Cx50 生物信息学分析真核表达质粒

小身材大作为——飞利浦Cx50可移动实时三维超声系统

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中国医疗设备 2015年第1期30卷 165-165,168页

＂进行床旁超声检查时,我无法依赖现有的小型便携超声,它总是无法提供满意的图像质量,尤其是遇到成像困难的患者时。就临床而言,我们需要小巧轻便,同时又具备优异图像的超声诊断系统。＂

关键词：实时三维超声图像质量 Cx50 超声诊断系统超声检查重症监护超声系统临床医生成像功能小巧轻便

先天性核性白内障家系致病基因的克隆及在真核细胞中的表达

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眼科研究 2009年第8期27卷 664-667页

作者：郑建秋刘平傅松滨哈尔滨医科大学第一临床医学院附属眼科医院 150001 哈尔滨医科大学 150001

目的克隆1个先天性核性白内障家系致病基因-突变型GJA8(mGJA8),研究其编码的蛋白质在真核细胞系中的表达和定位。方法从研究发现的先天性核性白内障家系患者基因组中扩增突变型mGJA8,克隆入载体pGEF-T,然后酶切,定向克隆到真核表达质粒p... 详细信息

目的克隆1个先天性核性白内障家系致病基因-突变型GJA8(mGJA8),研究其编码的蛋白质在真核细胞系中的表达和定位。方法从研究发现的先天性核性白内障家系患者基因组中扩增突变型mGJA8,克隆入载体pGEF-T,然后酶切,定向克隆到真核表达质粒pEGFP-N1中,构建pEGFP-N1-mGJA8重组表达质粒,然后用限制性内切酶消化和DNA测序鉴定,最后通过脂质体包埋转染法,用pEGFP-N1-mGJA8和pEGFP-N1质粒转染COS-7细胞,荧光显微镜观察其在COS-7细胞内的表达,采用细胞免疫组织化学法验证蛋白表达。结果经双酶切和DNA序列测定,证实致病基因mGJA8重组质粒构建成功,荧光显微镜观察在COS-7细胞上致病基因mGJA8蛋白表达,细胞免疫组织化学法显示致病基因表达蛋白在COS-7细胞中特异性表达。结论成功克隆出该家系的致病基因mGJA8,并且完成了该致病基因在体外真核细胞中的特异性表达,为进一步研究该家系的发病机制奠定基础。

关键词：先天性核性白内障 GJA8 突变型质粒 Cx50

飞利浦Cx50可移动高集成超声诊断系统在现代医院服务中的高效应用

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当代医学 2010年第12期 165-166页

对于正在积极加强医院服务建设的当值管理者,您是否曾经不止一次地听到手下干将们的抱怨:急救医疗时无法迅速调配高效的超声设备;手术室、ICU、介入室和麻醉科等地的便携式超声设备的图像质量让人头痛?!而每年一度的年终核算总结时,又... 详细信息

对于正在积极加强医院服务建设的当值管理者,您是否曾经不止一次地听到手下干将们的抱怨:急救医疗时无法迅速调配高效的超声设备;手术室、ICU、介入室和麻醉科等地的便携式超声设备的图像质量让人头痛?!而每年一度的年终核算总结时,又总是对超声设备的高额投入与单机收益回报没能达到预期而烦恼?

关键词：图像质量超声诊断 Cx50 飞利浦超声设备