Connexin突变导致先天性白内障的遗传学及功能分析

作     者：周政 

作者单位：河南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：胡延忠;崔秀坤

授予年度：2018年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100212[医学-眼科学] 10[医学] 

主      题：先天性白内障 Cx 46 Cx50 基因突变 膜定位 半通道功能损伤 

摘      要：背景白内障是由于晶状体浑浊,透光度降低引起的视力障碍,是人类致盲的主要原因之一。根据白内障发生时期不同可以将白内障分为先天性白内障和老年性白内障。而先天性白内障是儿童致盲的常见原因,先天性白内障多余多基因突变有关,根据致病基因的功能不同可以大致分为六大类:晶状体蛋白基因、间隙连接蛋白基因、发育调控因子基因、细胞骨架蛋白基因、酪氨酸激酶受体基因和染色质修复蛋白基因。间隙连接蛋白作为重要的细胞膜蛋白,是组成细胞间间隙连接通道的重要亚基,具有介导细胞之间生物小分子的转运功能,例如:代谢产物、离子和第二信使等。间隙连接在维持细胞稳态与晶状体分化及其稳态的过程中发挥着重要作用。在人类晶状体中组成间隙连接通道的亚基根据分子量不同可以分为:Cx43、Cx46和Cx50,它们分别由基因:GJA1、GJA3和GJA8基因编码。研究表明,GJA3和GJA8功能异常导致先天性白内障的发生。目前,已经发现超过20个GJA3基因突变和23个GJA8基因突变与人类先天性白内障相关,而GJA3或者GJA8基因的突变可能会导致其编码的Connexin的结构、功能等发生改变,继而影响细胞间间隙连接通道功能异常,最终诱发白内障。但是,间隙连接蛋白基因突变导致先天性白内障的具体分子机制并不完全清楚。目的1.鉴定两个常染色体显性遗传的先天性白内障家系的致病基因。2.初步探究GJA3和GJA8基因突变导致两个家系发生先天性白内障的分子机制。方法1.伦理授权在对白内障家系研究之前,我们向河南大学伦理委员会和开封中心医院伦理员会提交针对临床标本进行研究申请,并通过伦理委员会的审核。2.临床诊断与家系分析我们与开封市眼科医院合作收集到白内障家系,在取得家系成员知情同意的情况下,由专业眼科医生对家系成员进行详细的眼科检查(视力检查、裂隙灯检查)和相关病史的调查。通过绘制家系图谱初步确定家系患有的白内障的遗传方式。3.全血基因组DNA提取以及候选基因筛查及鉴定在确定家系患有的白内障并非其他疾病的并发症之后,我们抽取家系成员的外周血,随后抽提外周血基因组DNA,并利用PCR将11对候选基因(cryaa,cryab,crybb1,cybb2,crygc,crygd,GJA3,GJA8,Hsf4,Mip,Pitx3)进行扩增,将PCR产物进行外显子测序(金唯智公司)和基因序列分析,初步确定致病基因。4.利用免疫印迹法测定野生和突变间隙连接蛋白在病人晶状体组织中的表达量收集家系成员白内障手术中获取的晶状体前囊上皮组织,利用蛋白免疫印迹法检测家系中白内障患者与对照组老年性白内障病人晶状体中间隙连接蛋白的表达量。5.免疫荧光技术测定间隙连接蛋白亚细胞定位方式以及Cx50在小鼠晶状体的表达和分布情况构建表达GFP-WT-Cx50、GFP-Insert-Cx50,将质粒转染HLE细胞,利用免疫荧光技术观察Cx50在细胞中的定位方式。CX50在小鼠晶状体组织内的表达量和分布为了检测Cx50在小鼠晶状体中的分布情况,选取不同周龄(年龄)的小鼠,取其晶状体进行石蜡切片。随后进行免疫荧光染色,通过激光共聚焦显微镜观察Cx50在小鼠晶状体中的分布情况。6.间隙连接蛋白的半通道功能检测将 GFP-WT-Cx50、GFP-Insert-Cx50 质粒瞬时转染入 HLE,利用 dye uptake assay 检测PI染料通过野生型Cx50与突变型Cx50的能力,以此说明间隙连接蛋白的半通道功能是否发生异常。7.MTT实验测定突变型间隙连接蛋白对细胞增殖能力影响将GFP-WT-Cx50、GFP-Insert-Cx50质粒瞬时转染HLE细胞,利用MTT法,检测HLE细胞的增殖速度,以此说明突变型Cx50对细胞增殖能力的影响。结果1.CX46移码突变与一个家族显性遗传性白内障发生相关。应用遗传图谱分析技术,我们对一个患有先天白内障的家系进行分析,确定该家系为家族显性遗传性白内障家系。提取家系内正常人,先证和其他患者外周血的DNA,通过PCR扩增11对先天性白内障候选基因的外显子,并进行测序。结果显示,先证者GJA3基因cDNA的1195位点后插入碱基C(c.1194195ins C),导致Cx46 C末端400位氨基酸后发生移码突变(Cx46fs400),并且该突变在该家系里共分离。为了探究Cx46fs400对Cx46蛋白的影响,我们利用生物信息学对Cx46蛋白的生化性质进行预测。结果发现,该突变可能会引起Cx46的疏水性增加,同时可能会引起Cx46的二级结构发生改变。为了确定该突变是否会影响Cx46在病人晶状体中的蛋白稳定性,我们检测了该家系中先证者的晶状体组织中Cx46的表达水平。结果显示,Cx46fs400导致Cx46表达水平显著降低(CuiX K,Zhu K K,Zhou Z,et al.A novel frameshift mutation in CX46 associated with hereditary dominant cataracts in a Chinese family.[J].International Journal of Ophthalmology,2017,10(5):684-690.)。2.鉴定出一个新的GJA8基因插入突变(c.285ins)与家族显性遗传性白内障发生相关。通过对先天性白内障家系二(共三代10人,6患者)的家系遗传图谱分析,确定该家系的遗传方式为常染色体显性遗传。提取家系中正常人,先证者和其他患者的外周血的DNA,通过PCR技术扩增11对先天性白内障的候选基因的外显子,并进行测序。结果表明,先证者的GJA8的cDNA的285位点后插入了 15个碱基(tacgcggtgcactac)(c.285ins),导致Cx50第二跨膜区插入了五个氨基酸残基(YAVHY)(p.H9596insYAVHY)。通过免疫荧光技术检测结果显示,该突变引起了 Cx50由膜定位方式改变为胞质定位。利用dye uptake assay技术检测Cx50的半通道功能,结果显示,该突变引起了 Cx50的半通道功能受损。随后我们利用免疫荧光技术观察Cx50是否与内质网标志蛋白GRP78、溶酶体标志蛋白lampl共定位。结果显示,该突变能够引起Cx50与内质网、溶酶体共定位。MTT法检测瞬时转染GFP-WT-Cx50和GFP-Insert-Cx50的HLE细胞增殖速率。发现,该突变并不影响细胞的增殖。最后,为了探究Cx50在小鼠晶状体发育过程中的表达分布情况。我们选择4周龄的小鼠晶状体,进行石蜡切片和组织免疫荧光染色。结果显示,Cx50在小鼠晶状体赤道部分布表达较多。(Cui X,Zhou Z,Zhu K,et al.A Novel Cx50 Insert Mutation from a Chinese Congenital Cataract Family Impairs Its Cellular Membrane Localization and Function[J].Dna&Cell Biology,2018,37(5):449-456.)结论1.在一个家族显性遗传白内障家族DNA中,发现一个新的GJA3移码突变。GJA3 cDNA在1195位点后插入一个碱基C,导致Cx46蛋白从400位氨基酸开始移码,该移码突变可改变CX46蛋白的稳定性。2.在另一家族常染色体显性遗传白内障家系中,我们发现在GJA8基因cDNA285位点后插入15个碱基,这个新的突变体可导致Cx50第二跨膜区插入了五个氨基酸残基(YAVHY),该突变使Cx50的细胞膜定位方式异常,并且使Cx50的半通道功能受损。