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cofilin1棕榈酰化修饰调控HeLa细胞迁移与侵袭的分子机制

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Cofilin1棕榈酰化修饰调控HeLa细胞迁移与侵袭的分子机制

作者：刘爽新乡医学院

学位级别：硕士

背景cofilin1是肌动蛋白运动的调节因子,通过调控细胞骨架actin的重组促进伪足形成进而参与肿瘤细胞的运动,从而在肿瘤细胞转移与侵袭中起到不可或缺的作用。已有研究表明蛋白棕榈酰化修饰可能通过改变被修饰蛋白的功能进而影响了肿瘤... 详细信息

背景cofilin1是肌动蛋白运动的调节因子,通过调控细胞骨架actin的重组促进伪足形成进而参与肿瘤细胞的运动,从而在肿瘤细胞转移与侵袭中起到不可或缺的作用。已有研究表明蛋白棕榈酰化修饰可能通过改变被修饰蛋白的功能进而影响了肿瘤细胞的增殖或迁移。本课题前期通过分析宫颈癌及其癌旁组织的蛋白棕榈酰化组学发现cofilin1是潜在的棕榈酰化修饰蛋白。查阅文献发现cofilin1棕榈酰化修饰在宫颈癌中的分子功能和潜在调控机制未知。因此,本课题以cofilin1的棕榈酰化修饰为切入点,首先确定蛋白的棕榈酰化修饰位点,鉴别对其起修饰作用的棕榈酰化修饰酶和去棕榈酰化修饰酶,进而研究cofilin1的棕榈酰化修饰在宫颈癌迁移与侵袭中的作用,为探究cofilin1的棕榈酰化修饰对宫颈癌迁移与侵袭调控的分子机制奠定基础。目的通过验证cofilin1的棕榈酰化修饰及其动态调节过程,探究其棕榈酰化修饰对He La细胞迁移与侵袭的调控。方法***1棕榈酰化修饰的鉴定:ABE(Acyl-biotinyl exchange),RAC(Resin-assisted Capture),Western blot实验检测cofilin1的棕榈酰化修饰。***1棕榈酰化修饰位点的鉴定:构建突变体质粒,细胞转染,ABE,RAC,Western blot实验检测cofilin1的棕榈酰化修饰位点。***1的棕榈酰化修饰酶的鉴定:细胞转染,ABE,RAC,Western blot,实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)实验筛选cofilin1的棕榈酰化修饰酶。***1的去棕榈酰化修饰酶的鉴定:细胞转染,ABE,RAC,Western blot,免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation),细胞免疫荧光实验筛选cofilin1的去棕榈酰化修饰酶。***1的棕榈酰化修饰在细胞迁移和侵袭过程中的影响:细胞划痕,Transwell迁移及Transwell侵袭实验检测cofilin1的棕榈酰化修饰对He La细胞迁移与侵袭的影响。结果1.通过细胞转染,ABE,RAC,Western blot实验,结果显示NHOH处理的实验组cofilin1棕榈酰化修饰水平明显高于对照组;通过ABE,Western blot实验,结果显示随着2-BP加药处理时间的延长,cofilin1的棕榈酰化修饰水平信号逐渐减弱,并在药物处理10 h后抑制效果最明显,结果表明cofilin1是棕榈酰化修饰蛋白。2.通过蛋白纯化、质谱组学分析实验,结果显示Cys的棕榈酰化修饰所占比例为4.29%,Cys的棕榈酰化修饰比例所占为14.71%,Cys1的棕榈酰化修饰所占比例为12.77%,Cys的棕榈酰化修饰所占比例为10.87%。通过细胞转染,ABE,RAC,Western blot实验,结果显示Cys位点突变后棕榈酰化修饰水平下降明显,三位点突变体3C/A(C39A/C139A/C147A)的棕榈酰化修饰水平稍有降低;四位点突变体4C/A(C39A/C80A/C139A/C147A)的棕榈酰化修饰水平下降最显著,与对照组相比,差异有统计学意义(P1,Cys均为棕榈酰化修饰位点,且Cys位点的棕榈酰化修饰水平最高。3.通过细胞转染,ABE,RAC,Western blot实验,结果显示ZDHHC4,ZDHHC5,ZDHHC6能明显升高cofilin1的棕榈酰化修饰水平,与对照组相比,差异有统计学意义(Pcofilin1的棕榈酰化修饰酶。4.通过细胞转染,ABE,RAC,Western blot实验,结果显示PPT2能明显降低cofilin1的棕榈酰化修饰水平,与对照组相比,差异有统计学意义(Pcofilin1结合;通过细胞免疫荧光实验,结果显示在He La细胞中PPT2能与cofilin1发生共定位,结果表明PPT2是cofilin1的去棕榈酰化修饰酶。5.通过细胞划痕及Transwell迁移实验,结果显示过表达突变体C80A及去棕榈酰化修饰酶PPT2,He La细胞的愈合速率及穿膜数量均明显增加,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05);通过Transwell侵袭实验,结果显示过表达突变体C80A及去棕榈酰化修饰酶PPT2,He La细胞的穿膜数量明显增加,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05);结果表明Cofili

关键词： cofilin1 棕榈酰化修饰宫颈癌迁移和侵袭

cofilin1和Destrin蛋白在肺鳞癌中的表达及其与临床特征、预后的相关性研究

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Cofilin1和Destrin蛋白在肺鳞癌中的表达及其与临床特征、预后的...

作者：邓亚鹏南华大学

学位级别：硕士

目的:检测cofilin 1和Destrin蛋白在肺鳞癌组织及癌旁正常组织的表达,并探讨其与临床特征、预后的相关性。方法:收集湖南省肿瘤医院2010年1月到2012年4月104例肺鳞癌患者手术切除组织,选取其中34例癌旁组织正常组织作对照。所有患者的... 详细信息

目的:检测cofilin 1和Destrin蛋白在肺鳞癌组织及癌旁正常组织的表达,并探讨其与临床特征、预后的相关性。方法:收集湖南省肿瘤医院2010年1月到2012年4月104例肺鳞癌患者手术切除组织,选取其中34例癌旁组织正常组织作对照。所有患者的临床资料及临床病理资料均完整。所有患者均行肺鳞癌根治术,且所有患者术前均未行放、化疗。通过免疫组织化学染色方法,检测cofilin1和Destrin蛋白在不同年龄、性别、临床分期及生存时间的肺癌患者中的表达,分析cofilin1和Destrin蛋白表达与不同患者临床特征、生存预后的相关性。结果:cofilin1蛋白和Destrin蛋白免疫组织化学染色,均为显著胞浆着色;在本研究中的104例肺鳞癌患者和34例癌旁组织中,癌组织内cofilin1蛋白表达阳性例数为98例,阳性率为94.2%（98/104）,癌旁组织阳性例数为18例,阳性率为52.9%（18/34）,两者相比有统计学意义（P＜0.001）,癌组织内Destrin蛋白表达阳性例数为70例,阳性率为67.3%（70/104）,癌旁组织阳性例数为16例,阳性率为47.1%（16/34）,两者相比有统计学意义（P＜0.001）。其中cofilin1蛋白在男性患者阳性表达率为95.6%（88/92）,女性患者阳性率为83.3%（10/12）（P=0.141）;55岁年龄以内的患者,阳性率为91.7%（22/24）,大于55岁患者阳性率为95.0%（76/80）（P＜0.001）;肿瘤直径3cm以内的患者阳性率为88.9%（16/18）,大于3cm直径患者阳性率为95.3%（82/86）（P=0.029）;有吸烟史患者阳性率为95.4%（84/88）,无吸烟史患者阳性率为87.5%（14/16）（P=0.230）;在中分化+中低+低分化组患者阳性率为93.2%（82/88）;在高分化+高中分化组患者阳性率为100%（16/16）（P=0.587）;有淋巴结转移患者阳性率为91.6%（44/48）,无淋巴结转移患者阳性率为96.4%（54/56）（P=0.411）;在TNM分期（I期+II期）患者阳性率为94.1%（64/68）,III期患者阳性率为94.4%（34/36）（P=0.658）。Destrin蛋白在男性患者阳性表达率为65.2%（60/92）,女性患者阳性率为83.3%（10/12）（P=0.100）;55岁年龄以内的患者,阳性率为75%（18/24）,大于55岁患者阳性率为65.0%（52/80）（P=0.538）;肿瘤直径3cm以内的患者阳性率为44.4%（8/18）,大于3cm直径患者阳性率为72.0%（62/86）（P＜0.001）;有吸烟史患者阳性率为70.4%（62/88）,无吸烟史患者阳性率为50.0%（8/16）（P=0.147）;在中分化+中低+低分化组患者阳性率为63.6%（56/88）,在高分化+高中分化组患者阳性率为87.5%（14/16）（P=0.083）;有淋巴结转移患者阳性率为70.8%（34/48）,无淋巴结转移患者阳性率为64.3%（36/56）（P＜0.001）;在TNM分期（I期+II期）患者阳性率为61.8%（42/68）,III期患者阳性率为77.8%（28/36）（P=0.125）。cofilin1蛋白阳性表达组和阴性表达组的PFS和OS统计学分析显示无显著差异,P值分别为0.427和0.194。Destrin蛋白阳性表达组和阴性表达组的PFS和OS统计学分析显示有显著差异,P值分别为0.016和0.045。结论:1、cofilin1蛋白在肺鳞癌患者组织中显著高表达;表达水平与患者年龄、肿瘤大小存在相关性。2、Destrin蛋白在肺鳞癌患者组织中显著高表达;表达水平与患者肿瘤大小、淋巴结转移以及患者生存预后存在相关性,可作为预测肺鳞癌患者预后的参考指标之一。

关键词：肺鳞癌免疫组织化学 cofilin1 Destrin 生存预后

PTPRN2通过cofilin1和TRAF2促进多倍体肿瘤巨细胞及其子代细胞转移侵袭的机制

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PTPRN2通过Cofilin1和TRAF2促进多倍体肿瘤巨细胞及其子代细胞转...

作者：陈静安徽医科大学

学位级别：硕士

目的:本课题组前期研究证实缺氧模拟剂氯化钴（cobalt chloride,CoCl2）、放射线以及化疗药可以诱多种肿瘤产生多倍体肿瘤巨细胞（polyploid giant cancer cells,PGCCs）。多倍体肿瘤巨细胞具有肿瘤干细胞的特性,自我更新慢并具备抵抗... 详细信息

目的:本课题组前期研究证实缺氧模拟剂氯化钴（cobalt chloride,CoCl2）、放射线以及化疗药可以诱多种肿瘤产生多倍体肿瘤巨细胞（polyploid giant cancer cells,PGCCs）。多倍体肿瘤巨细胞具有肿瘤干细胞的特性,自我更新慢并具备抵抗各种不利刺激的能力。此外,PGCCs可以通过不对称分裂的方式产生高侵袭增殖能力的子代细胞,这可能与肿瘤化疗后的复发、转移和侵袭密切相关。目前治疗结直肠腺癌的最常见一线化疗药是5氟尿嘧啶和奥沙利铂。前期实验已证实PTPRN2在氯化钴诱导出的PGCCs及其子代细胞中高表达,并与其子代细胞的高侵袭能力有关。本研究以人结直肠癌细胞系HCT116和LoVo为研究对象,利用化疗药5氟尿嘧啶和奥沙利铂诱导该细胞系的PGCCs。本文通过探索PTPRN2调控PGCCs及其子代细胞高侵袭增殖的分子机制,进一步为治愈结直肠腺癌提供新思路和治疗靶点。方法:（1）利用Oncomine、GEPIA和UALCAN数据库分析PTPRN2在结直肠腺癌中的mRNA的表达状况;The Human Protein Atlas数据库分析PTPRN2在结直肠癌和正常结直肠组织之间的蛋白质表达状况和定位;免疫印迹实验检测PTPRN2蛋白在正常结肠细胞和几种结直肠癌细胞系中的表达状况。（2）利用UALCAN探索PTPRN2启动子区的DNA甲基化状况;MethSurv数据库分析PTPRN2基因中CpG岛甲基化状况与患癌患者预后的相关性;cBioPortal数据库分析在结直肠癌中PTPRN2基因改变状况及对患者的预后的影响。（3）利用TIMER、TIGIBA及GEPIA数据库观察PTPRN2与微环境中肿瘤免疫之间的关系及其是否影响结直肠癌的预后。利用LinkedOmics数据库和GSEA工具进行PTPRN2的GO分析和KEGG通路分析。（4）利用5氟尿嘧啶和奥沙利铂处理HCT116细胞和LoVo细胞48h诱导多倍体肿瘤巨细胞及其子代细胞用作实验组;免疫印迹实验检测PTPRN2蛋白在HCT116和LoVo细胞的control组和PGCCs及其子代细胞中的表达状况;免疫细胞化学染色比较PTPRN2在对照组和实验组中的表达及定位状况。（5）通过平板克隆实验、划痕-愈合实验、Transwell迁移和侵袭实验、Ki67细胞染色比较PGCCs及其子代细胞与对照组,PGCCs及其子代细胞敲低PTPRN2前后的迁移、增殖及侵袭能力。（6）小干扰RNA（siRNA）敲低PGCCs及其子代细胞中的PTPRN2,Western Blot实验检测PTPRN2蛋白调控的下游蛋白的表达状况。（7）免疫共沉淀实验技术分别检测PTPRN2蛋白与TRAF2、Twist1和CyclinD1蛋白之间的相互作用;流式分析检测对照组与实验组,小干扰RNA敲低PTPRN2前后的细胞周期分布状况。结果:（1）在结直肠腺癌中PTPRN2的mRNA表达水平明显高于正常的结直肠组织。此外,PTPRN2与结肠癌中的病理分期和转移分级有关。免疫组化染色证实PTPRN2蛋白在结直肠腺癌中的表达高于正常结直肠组织。与正常IEC6细胞相比,PTPRN2蛋白在结直肠癌细胞中的表达升高,尤其是HCT116和LoVo细胞。（2）与正常结直肠组织相比,PTPRN2在结直肠腺癌中的启动子甲基化水平明显降低。在结直肠腺癌中PTPRN2基因中的分别有23个和11个CpG位点的低甲基化与结肠腺癌患者的不良预后有关。此外,在结直肠腺癌患者中PTPRN2基因发生了 2.6%的改变,而且其总生存期高于未发生基因改变组。（3）PTPRN2广泛参与调节结直肠腺癌患者的多种免疫分子。在富含Type 1辅助T细胞和调节T细胞的肿瘤微环境中,PTPRN2的高表达与直肠腺癌患者的不良预后有关。另外,KEGG分析发现PTPRN2主要参与胰岛素分泌、黏着连接、神经突触传递、激素合成和分泌、cGMP-PKG信号、cAMP信号和FoxO信号通路等等富集。（4）化疗药5-氟尿嘧啶和奥沙利铂诱导出HCT116和LoVo细胞PGCCs形成,PGCCs在经历静止恢复期后产生子代细胞。PGCCs及其子代细胞的迁移、侵袭、增殖能力及ki67染色强度高于对照组。与对照组相比,PTPRN2在PGCCs及其子代细胞中的表达升高。（5）小干扰RNA敲低PTPRN2的表达后,PGCCs及其子代细胞的恶性生物学行为明显减弱。与阴性对照组相比,敲低PTPRN2后的PGCCs及其子代细胞中的 cofilin1 蛋白、TRAF2 蛋白以及 EMT过程、JAK2/STAT3/CyclinD 1通路、PI3K/AKT通路、MAPK通路相关蛋白表达亦相应下降。此外,免疫共沉淀实验发现,PTPRN2与TRAF2、Twist1和CyclinD1之间存在

关键词：结直肠癌多倍体肿瘤巨细胞 PTPRN2 TRAF2 cofilin1 侵袭

轴突导向因子Semaphorin3a调节cofilin1的磷酸化在骨癌痛中的机制研究

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轴突导向因子Semaphorin3a调节Cofilin1的磷酸化在骨癌痛中的机制...

作者：史若诗武汉大学

学位级别：硕士

骨癌痛是由于原发肿瘤生长或转移致骨破坏所引起的自发性或诱发性疼痛。约70%晚期乳腺癌患者出现骨转移,40%患者遭受顽固性疼痛,严重影响长期生存率。目前骨癌痛的临床阶梯式镇痛方法,因药物的剂量依赖性副作用明显而使镇痛效果受限,因... 详细信息

骨癌痛是由于原发肿瘤生长或转移致骨破坏所引起的自发性或诱发性疼痛。约70%晚期乳腺癌患者出现骨转移,40%患者遭受顽固性疼痛,严重影响长期生存率。目前骨癌痛的临床阶梯式镇痛方法,因药物的剂量依赖性副作用明显而使镇痛效果受限,因此对其机制的研究尤为重要。目前研究认为,神经系统中的突触连接或突触传递在结构或功能上具有可修饰的特性,并在痛觉的感受和调节机制中有重要作用。突触前膜与后膜内肌动蛋白微丝的聚合与解聚,为突触间的递质传递及结构重塑提供重要的结构基础。在突触的特异性发育与精确调控过程中,轴突导向因子Semaphorin3a（Sema3a）参与突触前后膜的形成与调节,并在肿瘤中呈现不同程度的缺失。肌动蛋白解聚因子cofilinl可接受上游磷酸化调节,在去磷酸化的激活状态下解聚肌动蛋白,并在Ser3位点接受磷酸化而失活。在突触前膜中,突触蛋白synapsin Ⅰ与肌动蛋白结合,调控突触囊泡的锚定与解离,影响神经递质的释放。在突触后膜中,肌动蛋白的变化可影响兴奋性谷氨酸AMPA受体向膜上嵌入。我们前期免疫荧光预实验的结果显示,Semma3a在脊髓背角浅层分布明显,可与突触前后膜的特异性标记物共定位,且定量结果显示骨癌痛中Sema3a与cofilinl含量下降,提示Sema3a与cofilinl可能参与骨癌痛的维持。据此我们推测Sema3a可能调节cofilinl的磷酸化,使前膜中synapsin Ⅰ及后膜的AMPA受体发生改变,影响脊髓背角的兴奋性突触传递功能,从而维持骨癌痛的发生发展。本实验中,我们采用免疫荧光、Western blot及PT-PCR等方法,并构建Sema3a与cofilinl的过表达慢病毒,来进一步探索磷酸化的cofilinl（P-cofilin）、synapsin Ⅰ、AMPAR的含量变化以及它们之间的相互作用。结果显示,骨癌痛中P-cofilin/cofilinl比值下降,磷酸化失活的cofilinl含量明显下调,激活状态的cofilinl比例增多,可促进肌动蛋白的重新组装;突触前膜内P-cofilin与synapsin Ⅰ共定位的比值比正常组升高3倍,synapsin Ⅰ含量下降失活,对突触囊泡的抑制作用解除;突触后膜中AMPAR增高,使兴奋性突触传递过程增强。给予Sema3a过表达慢病毒,P-cofilin水平恢复,synapsinⅠ上调,AMPAR下降,使大鼠的疼痛阈值升高,疼痛缓解。因此,本实验以期从一个新的角度揭示骨癌痛发生的机制,为临床靶向治疗提供有力的理论证据。

关键词： Semaphorin3a cofilin1 骨癌痛突触重塑

二烯丙基二硫下调cofilin1诱导人白血病HL-60细胞分化

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二烯丙基二硫下调cofilin1诱导人白血病HL-60细胞分化

作者：贾艳红南华大学

学位级别：硕士

目的：研究二烯丙基二硫（diallyl disulfide, DADS）下调cofilin1抑制人白血病HL-60细胞增殖、迁移与侵袭以及诱导分化的分子机制。方法：运用RT-PCR、Western blot、免疫细胞化学技术观察DADS对HL-60细胞cofilin1表达的影响以及Rac1-... 详细信息

目的：研究二烯丙基二硫（diallyl disulfide, DADS）下调cofilin1抑制人白血病HL-60细胞增殖、迁移与侵袭以及诱导分化的分子机制。方法：运用RT-PCR、Western blot、免疫细胞化学技术观察DADS对HL-60细胞cofilin1表达的影响以及Rac1-Rock1-LIMK1信号通路的改变。采用RNA干扰技术，将干扰cofilin1的miRNA质粒pcDNA6.2-GW/EmGFPmiR-cofilin1瞬时转染人白血病HL-60细胞，RT-PCR、Western blot技术检测干扰效果并观察沉默cofilin1后HL-60细胞的cofilin1表达变化。MTT比色法、NBT还原实验、Transwell实验观察DADS和沉默cofilin1对HL-60细胞增殖、还原能力及侵袭能力的影响。结果： ***对人白血病HL-60细胞cofilin1表达的影响 RT-PCR、Western blot显示，1.25mg·L-1DADS分别处理人白血病HL-60细胞0、12、24、48h后，与未处理组比较，cofilin1在mRNA水平、蛋白水平表达呈时间依赖性下降（Pcofilin1在胞浆上表达呈强阳性，1.25mg·L-1DADS处理12、24、48h后cofilin1表达减弱，表明cofilin1在蛋白水平表达呈时间依赖性下降。 ***下调cofilin1对人白血病HL-60细胞迁移能力的影响迁移实验显示，1.25mg·L-1DADS分别处理人白血病HL-60细胞12、24h后，与未处理组相比，HL-60细胞迁移能力呈时间依赖性下降（Pcofilin1对DADS抑制HL-60细胞cofilin1表达的影响 pcDNA6.2-GW/EmGFPmiR-cofilin1干扰质粒提取后，瞬时转染HL-60细胞，48h后倒置荧光显微镜下可见转染细胞发绿色荧光，表明转染成功。 RT-PCR显示，转染cofilin1-miRNA的HL-60细胞cofilin1基因表达水平与阴性转染组相比下降，第1转染组基因表达抑制最明显。 Western blot显示，转染cofilin1-miRNA的HL-60细胞其cofilin1蛋白表达水平与阴性转染组相比下降，第1转染组基因表达抑制最明显，与RT-PCR结果结果一致，故后续实验采用cofilin1-miRNA1作为实验对象。 RT-PCR、Western blot显示，DADS分别处理未转染组、阴性转染组和干扰组48h后，cofilin1在基因和蛋白水平表达均明显低于未处理的未转染组、阴性转染组和干扰组（Pcofilin1在基因和蛋白水平可协同抑制cofilin1表达。 4.沉默cofilin1对DADS诱导HL-60细胞分化的影响 MTT显示，与DADS处理的未转染组和阴性转染组相比，DADS处理的干扰组细胞增殖抑制明显(Pcofilin1可协同抑制HL-60细胞增殖。 NBT显示，1.25mg·L-1DADS处理干扰组HL-60细胞48h后，细胞分化能力明显高于DADS处理的阴性转染组(P1.25mg L-1DADS与ARTA比较无显著差异性(P＞0.05)。 Transwell侵袭显示，DADS处理的未转染组、阴性转染组和干扰组穿过基质胶的细胞数均较未处理前显著减少（P0.05）。表明沉默cofilin1基因可增强DADS对HL-60细胞侵袭能力的抑制作用。 5. DADS对Rac1-Rock1-LIMK1-cofilin1信号通路的影响 RT-PCR、Western blot显示，DADS分别处理人白血病HL-60细胞12、24、48h后,与未处理组比较，Rac1、Rock1、LIMK1及p-cofilin1在mRNA、蛋白水平表达呈时间依赖性下降（P1. DADS可下调cofilin1诱导HL-60细胞分化。 2.沉默cofilin1可增强DADS诱导HL-60细胞分化能力。 3. DADS通过抑制Rac1-Rock-LIMK1通路下调与灭活cofilin1诱导HL-60细胞分化。

关键词：二烯丙基二硫 cofilin1 人白血病HL-60细胞 miRNA干扰分化

二烯丙基二硫对高表达cofilin1白血病HL-60细胞分化的影响

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二烯丙基二硫对高表达cofilin1白血病HL-60细胞分化的影响

作者：雷艳萍南华大学

学位级别：硕士

目的：研究二烯丙基二硫(DADS)对人白血病HL-60细胞中cofilin1表达以及其增殖、迁移、侵袭与分化的影响，并探讨其作用的分子机制。方法：RT-PCR和Western blot检测DADS对HL-60细胞中的cofilin1及p-cofilin1表达的影响以及信号通路Rac1-... 详细信息

目的：研究二烯丙基二硫(DADS)对人白血病HL-60细胞中cofilin1表达以及其增殖、迁移、侵袭与分化的影响，并探讨其作用的分子机制。方法：RT-PCR和Western blot检测DADS对HL-60细胞中的cofilin1及p-cofilin1表达的影响以及信号通路Rac1-ROCK1-LIMK1中各因子表达的改变。通过细胞转染技术，将高表达cofilin1基因的重组质粒pcDNA3.1-CFL1-IRES2-EGFP稳定转染HL-60细胞，构建高表达cofilin1的HL-60/pcDNA3.1/cofilin1-EGFP细胞系。RT-PCR和Western blot检测转染后HL-60细胞cofilin1表达的变化，并观察DADS对高表达cofilin1的HL-60细胞中cofilin1表达的影响;NBT细胞还原实验、CCK-8增殖检测实验、Transwell迁移和侵袭实验以及细胞免疫荧光观察DADS对HL-60细胞及高表达cofilin1的HL-60细胞生物学特性的影响;RT-PCR和Western blot检测DADS对高表达cofilin1的HL-60细胞Rac1-ROCK1-LIMK1信号通路的影响。结果：1. DADS对HL-60细胞的cofilin1表达的影响RT-PCR和Western blot显示，DADS作用HL-60细胞0h、6h、12h、24h、48h后，cofilin1和p-cofilin1在mRNA表达水平和蛋白表达水平表现为时间依赖性的下降(P0.05)。3. DADS对高表达cofilin1的HL-60细胞中cofilin1表达的影响构建高表达cofilin1的真核表达载体pcDNA3.1-CFL1-IRES2-EGFP，稳定转染HL-60细胞，RT-PCR和Western blot显示，转染cofilin1的高表达载体的后，HL-60细胞中cofilin1mRNA和蛋白表达水平与未转染组及阴性转染组细胞比较明显上升，表明HL-60/pcDNA3.1/cofilin1-EGFP细胞系构建成功。RT-PCR与Western blot显示，DADS处理前后，未转染组、阴性转染组及高表达组细胞的cofilin1和p-cofilin1在mRNA和蛋白表达水平具有统计学差异(Pcofilin1的HL-60细胞的分化的影响NBT实验结果显示，DADS分别处理未转染组、阴性转染组和高表达组细胞24h后，HL-60细胞对硝基蓝四唑的还原能力较未处理组细胞明显增强(P0.05)。CCK-8实验结果显示，DADS处理后，未转染组、阴性转染组及高表达组细胞的增殖能力较未处理的各组均减弱，且未转染组和阴性转染组细胞较高表达组细胞的增殖抑制更明显(P0.05)。表明高表达cofilin1可以减弱DADS对HL-60细胞的增殖抑制作用。Transwell迁移和侵袭实验结果显示，DADS分别处理未转染组、阴性转染组及高表达组细胞后，其细胞穿过膜和基质胶的数量较未处理的各组细胞均减小(P0.05)。表明高表达cofilin1可以减弱DADS对HL-60细胞的迁移、侵袭抑制作用。细胞免疫荧光结果显示，DADS处理后，未转染组、阴性转染组及高表达组细胞的CD11b蛋白表达水平较未处理的各组明显上升，CD33蛋白表达水平较未处理的各组明显下调。5. DADS对HL-60细胞中的Rac1-ROCK1-LIMK1信号通路的影响RT-PCR和Western blot结果显示，DADS作用HL-60细胞0h、6h、12h、24h、48h后，Rac1、ROCK1、LIMK1及p-LIMK1的mRNA和蛋白表达水平表

关键词：二烯丙基二硫 cofilin1 细胞转染 HL-60细胞分化

食管癌组织cofilin1和Twist1表达与食管癌临床病理特征及预后的关系

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中华实用诊断与治疗杂志 2021年第11期35卷 1115-1118页

作者：杜庆胜郝晓炜张志伟山东省立第三医院胸外科山东济南250013 青岛市第八人民医院消化内科山东青岛266000

目的观察食管癌组织cofilin1和Twist1表达变化,探讨其与食管癌患者临床病理特征及预后的关系。方法食管癌患者86例,均行手术治疗,Ⅰ~Ⅱ期患者术后行辅助放疗,Ⅲ期患者术后行辅助放化疗。取手术切除癌组织及癌旁组织,采用免疫组织化学法... 详细信息

目的观察食管癌组织cofilin1和Twist1表达变化,探讨其与食管癌患者临床病理特征及预后的关系。方法食管癌患者86例,均行手术治疗,Ⅰ~Ⅱ期患者术后行辅助放疗,Ⅲ期患者术后行辅助放化疗。取手术切除癌组织及癌旁组织,采用免疫组织化学法检测cofilin1、Twist1表达。比较癌组织与癌旁组织cofilin1、Twist1阳性表达率;比较不同临床病理特征食管癌患者癌组织cofilin1、Twist1阳性表达率;随访5年,比较癌组织cofilin1阳性表达与阴性表达、Twist1阳性表达与阴性表达食管癌患者总生存率。结果食管癌患者癌组织cofilin1、Twist1阳性表达率(66.3%、73.3%)均高于癌旁组织(11.6%、13.9%)(Pcofilin1(88.5%、91.4%)、Twist1(96.2%、88.6%)阳性表达率分别高于临床分期Ⅰ~Ⅱ期(56.7%、63.6%)、无淋巴结转移(49.0%、62.7%)者(Pcofilin1、Twist1阳性表达率比较差异均无统计学意义(P>0.05)。86例患者均未失访,5年总生存率为20.9%。癌组织cofilin1阳性表达者5年总生存率(10.5%)低于cofilin1阴性表达者(41.4%)(P1阳性表达者5年总生存率(9.5%)低于Twist1阴性表达者(52.2%)(Pcofilin1、Twist1阳性表达率升高,与临床分期晚、有淋巴结转移、预后差有关。

关键词：食管癌 cofilin1 Twist1 预后

南蛇藤提取物通过cofilin 1调控细胞骨架重组抑制人胃癌细胞上皮间质转化(EMT)的研究

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时珍国医国药 2016年第2期27卷 303-307页

作者：王海波钱亚云朱耀东顾昊陈珏王萱怡金凤史有阳赵敏陆松花刘延庆扬州大学-扬州市肿瘤研究所扬州大学肿瘤防治重点实验室扬州大学医药研究所江苏扬州225001

目的研究南蛇藤乙酸乙酯提取物(Celastrus orbiculatus extracts,COE)对TGF-β1诱导的人胃癌SGC-7901细胞EMT的影响。方法 TGF-β1诱导人胃癌SGC-7901细胞造模,设阴性对照组、模型组和不同浓度COE实验组。MTT法检测细胞毒作用和生长抑... 详细信息

目的研究南蛇藤乙酸乙酯提取物(Celastrus orbiculatus extracts,COE)对TGF-β1诱导的人胃癌SGC-7901细胞EMT的影响。方法 TGF-β1诱导人胃癌SGC-7901细胞造模,设阴性对照组、模型组和不同浓度COE实验组。MTT法检测细胞毒作用和生长抑制作用;Transwell小室法检测细胞的侵袭和转移能力;Western blot法检测细胞EMT生物标志分子(biomarker)E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白、波形蛋白和相关的丝切蛋白1(cofilin 1)、基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinases2,MMP-2)、MMP-9蛋白的表达水平;TRITC-标记的鬼笔环肽细胞骨架荧光染色,激光共聚焦显微镜检测细胞骨架。结果与模型组相比:COE能下调人胃癌SGC-7901细胞的cofilin 1蛋白水平和EMT标志蛋白N-钙黏蛋白、波形蛋白的表达水平,同时上调E-钙黏蛋白的表达水平,显著抑制人胃癌SGC-7901细胞的EMT进程,呈明显的剂量依赖性;COE能降低人胃癌SGC-7901细胞的穿膜细胞数;另外COE(10、20、40mg/L)能下调人胃癌SGC-7901细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达水平;COE能明显抑制细胞骨架发生改变。结论 COE能明显抑制人胃癌SGC-7901细胞EMT进程,降低细胞侵袭和转移能力,其机制可能与抑制细胞骨架改变和降低cofilin 1、MMP-2、MMP-9蛋白的表达水平有关。

关键词：南蛇藤提取物胃癌 cofilin1 上皮间质转化细胞骨架

RNA干扰LIMK1对DADS抑制人胃癌MGC803细胞迁移与侵袭的作用

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RNA干扰LIMK1对DADS抑制人胃癌MGC803细胞迁移与侵袭的作用

作者：章硕南华大学

学位级别：硕士

目的：研究证明，LIMK（Lim kinase）是调控细胞骨架结构发生改变的重要分子之一，在肿瘤细胞侵袭转移中的作用得到研究者广泛的关注。本实验室前期蛋白质组学检测二烯丙基二硫（diallyl disulfide，DADS）处理人胃癌MGC803细胞后，LIM... 详细信息

目的：研究证明，LIMK（Lim kinase）是调控细胞骨架结构发生改变的重要分子之一，在肿瘤细胞侵袭转移中的作用得到研究者广泛的关注。本实验室前期蛋白质组学检测二烯丙基二硫（diallyl disulfide，DADS）处理人胃癌MGC803细胞后，LIMK下降。且证明DADS可通过下调LIMK1抑制人胃癌MGC803细胞迁移侵袭，本研究旨在探讨RNA干扰LIMK1对DADS抑制人胃癌MGC803细胞迁移侵袭的作用，以阐明LIMK1是抗肿瘤细胞转移和侵袭的重要分子。方法：RNA干扰人胃癌MGC803细胞LIMK1，RT-PCR和Western blot检测干扰效率;细胞划痕和transwell实验分别检测干扰LIMK1和DADS对人胃癌MGC803细胞迁移与侵袭能力的影响;Western blot检测Rac1、Rock1、Pak1、LIMK1、cofilin1、p-cofilin1蛋白水平表达。结果： 1、pcDNA6.2/LIMK1-miRNA/MGC803重组细胞的构建四组pcDNA6.2-GW/EmGFPmiR-LIMK1干扰质粒及阴性干扰质粒琼脂糖电泳跑胶呈马蹄形，表示质粒提取成功。将提取的5组干扰质粒分别转入MGC803细胞，倒置荧光显微镜下可见细胞发绿色荧光。Western blot结果显示，与未转染组相比，转染LIMK1-miRNA1-4分别使MGC803细胞LIMK1蛋白表达水平下降30%、28%、72%、75%，LIMK1-miRNA4转染组LIMK1蛋白表达抑制最明显（P＜0.05），阴性转染组与未转染组相比之间无统计学意义（P＞0.05）。RT-PCR结果显示，LIMK1-miRNA1、LIMK1-miRNA4组LIMK1mRNA下降明显。综合Western blot和RT-PCR结果，采用LIMK1-miRNA4/MGC803细胞作为后续实验对象。 2、RNA干扰LIMK1对DADS抑制MGC803细胞迁移与侵袭的影响划痕实验显示，24h后，干扰组划痕距离较未干扰组、阴性干扰组增宽（P＜0.05）;未干扰组与阴性干扰组无差异（P＞0.05）。30mg·L-1DADS处理24h后，干扰组较未干扰组与阴性干扰组明显增宽（P＜0.05），未干扰组与阴性干扰组差异无明显差异（P＞0.05），干扰组加药前后无意义。表明干扰LIMK1可抑制MGC803细胞迁移。 Transwell侵袭实验显示，24h后，干扰组和DADS处理干扰组穿膜细胞较未干扰组、阴性干扰组明显减少（P＜0.05）;未干扰组与阴性干扰组差异无统计学意义（P＞0.05）。表明干扰LIMK1可抑制MGC803细胞侵袭，并增强DADS抑制MGC803细胞侵袭能力。 3. RAN干扰LIMK1与DADS对Rac1-Rock1/Pak1-LIMK1-cofilin1信号通路的影响。 Western blot结果显示，干扰组的Rac1、Rock1、Pak1、cofilin1蛋白表达较未干扰组无统计学意义，LIMK1、p-cofilin1蛋白表达均下降，未干扰组与阴性干扰组无统计学意义。30mg·L-1DADS处理24h后，干扰组的Rac1、Rock1、Pak1蛋白表达均较处理前下降，LIMK1、p-cofilin1、cofilin1蛋白表达无差异;未干扰组与阴性干扰组无统计学意义。结论： 1、RNA干扰LIMK1可抑制MGC803细胞迁移与侵袭。 2、RNA干扰LIMK1增强DADS抑制MGC803细胞侵袭。 3、RNA干扰LIMK1可下调磷酸化cofilin1，抑制MGC803细胞迁移与侵袭。

关键词：二烯丙基二硫人胃癌 MGC803细胞 LIMK1 RNA干扰迁移侵袭 Rac1 Rock1 Pak1 cofilin1 p-cofilin1