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鉴别非洲猪瘟野毒株与基因缺失疫苗株的三重TaqMan探针荧光定量PCR检测方法的建立

中国兽医科学 2022年第8期52卷 939-945页

作者：宋影影刘英楠刘建奇谢振华于婉琪吕璐钟秋萍宋庆庆陈鸿军中国农业科学院上海兽医研究所上海200241 中国农业科学院生物安全研究中心上海200241 金宇保灵生物制药有限公司内蒙古呼和浩特010030

为建立一种鉴别非洲猪瘟野毒株与基因缺失疫苗株的TaqMan探针荧光定量PCR检测方法,根据非洲猪瘟病毒(ASFV)的B646L、EP402R、MGF360-13l基因序列,分别设计PCR引物和TaqMan探针,绘制标准曲线,并进行重复性试验、特异性试验、敏感性试验... 详细信息

为建立一种鉴别非洲猪瘟野毒株与基因缺失疫苗株的TaqMan探针荧光定量PCR检测方法,根据非洲猪瘟病毒(ASFV)的B646L、EP402R、MGF360-13l基因序列,分别设计PCR引物和TaqMan探针,绘制标准曲线,并进行重复性试验、特异性试验、敏感性试验与临床样品检测,建立三重TaqMan探针荧光定量PCR检测方法。结果显示,以B646L、EP402R和MGF360-13l重组质粒为标准品绘制的标准曲线具有良好的线性关系,线性相关系数(R^(2))分别为0.995、0.997和0.997;建立的方法与多种猪常见病原不存在交叉反应,特异性良好;对B646L、MGF 360-13l与EP402R基因的检测下限均为10^(2.5) copies/μl,变异系数均l时仍能检测到病毒粒子,具有较高的临床使用价值。本研究建立了一种高效、灵敏、特异的ASFV分子检测方法,对ASF风险预警具有重要意义。

关键词：非洲猪瘟病毒 B646L EP402R MGF360-13l TaqMan探针荧光定量PCR

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基于RAA-CRISPR/Cas12a的非洲猪瘟病毒核酸检测方法的研究

基于RAA-CRISPR/Cas12a的非洲猪瘟病毒核酸检测方法的研究

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作者：池进进山东农业大学

学位级别：硕士

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的一种急性、烈性和高度接触性传染病,可感染不同品种及日龄的家猪和野猪,病死率高达100%,这给养猪业造成逾百亿的直接经济损失。由于ASF尚无... 详细信息

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的一种急性、烈性和高度接触性传染病,可感染不同品种及日龄的家猪和野猪,病死率高达100%,这给养猪业造成逾百亿的直接经济损失。由于ASF尚无有效的治疗方法和商品化疫苗,只能依靠快速诊断和扑杀等防控手段来控制该病的传播。目前针对ASFV的检测方法虽各有优势,但大多仍需要依赖大型实验室仪器设备和专业的操作人员,难于满足现场快速检测的需求,因此开发灵敏快速、操作简单、判读方便的ASFV检测方法对ASF的预防与控制具有重要意义。近些年来,存在于大多数细菌与所有古菌中的防御机制CRISPR/Cas系统逐渐走入人们视野,其中CRISPR/Cas12a因具核酸外切酶活性(切割靶标ds DNA后还可非特异性切割其他ss DNA)已成为病原核酸检测的研究热点。重组酶介导核酸扩增技术(RAA)是一种利用重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶在恒温条件(如37°C)下扩增DNA的方法,其不需要精密的热循环仪器,在恒温条件下就可完成目标核酸的指数扩增,在现场检测具有优势,扩增快且操作简单。本研究基于上述两种检测技术,通过将RAA与CRISPR/Cas12a的切割反应相结合,建立了无需昂贵仪器设备和专业操作人员的ASFV检测方法。具体研究结果如下:1.成功表达纯化了AsCas12a蛋白,并验证其具有切割活性。将p MbP-AsCas12a质粒转入大肠杆菌bl21(DE3)后,在IPTG浓度为0.5 m M,温度为30°C,180r/min的诱导条件下2.5 h成功诱导出所需蛋白,并通过镍柱和MbP标签纯化柱纯化出了AsCas12a蛋白。2.成功构建阳性标准质粒及设计了针对ASFV并适用于Cas12a的g RNA。根据Gen bank上公布的ASFV保守的B646L基因设计PCR引物,以合成完整的B646L序列为模板,构建PMD-19T-p72标准阳性质粒;在ASFV高度保守的B646L基因序列中,根据Cas12a所识别的PAM序列设计了g RNA,经检测验证了g RNA的可行性。3.根据相应靶点成功设计了RAA引物,等温扩增的结果表明引物可以扩增靶标序列并可以用于检测。4.成功建立了基于CRISPR/Cas12a的ASFV检测方法并进行了体系优化。结果显示所设计的两条g RNA中g RNA2效果相对较好,检测体系的Cas12a蛋白和g RNA最佳浓度分别为200 n M和150 n M,荧光检测反应30 min、试纸条检测反应20 min后孵育4 min均可得到可靠结果。5.对该检测方法的特异性、灵敏性以及重复性进行了评估,结果显示该方法特异性良好,与PCV2、PCV3、PRRSV、PRV、CSFV阳性样品均未无交叉反应,荧光检测与试纸条检测的检测下限均为10 copies/μl,同时该方法具有良好重复性,多批次检验不同拷贝数阳性样品后,批内变异系数小于5%,批间变异系数小于10%。综上所述,本研究建立了一种可在恒温条件(37°C)下实现快速检测ASFV的方法,结果可通过蓝光照射或试纸条直接判读,具有良好的灵敏性与特异性,且操作简单、无需昂贵实验仪器设备及适用于临床检测,为ASFV的快速诊断及流行病学调查提供了切实可行的技术手段。

关键词：非洲猪瘟 B646L 重组酶介导等温扩增技术 CRISPR/Cas12a 检测方法

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非洲猪瘟病毒lAMP比色法和实时荧光PCR法的建立与比较

非洲猪瘟病毒LAMP比色法和实时荧光PCR法的建立与比较

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作者：李永秀河北科技师范学院

学位级别：硕士

自2018年我国出现首例非洲猪瘟以来,疫情已波及31个省份,严重影响猪的生产性能,制约着经济的发展,对公共卫生安全造成了不可小觑的危害。目前,全球尚未出现行之有效的商品非洲猪瘟病毒疫苗。因此非洲猪瘟检测在疫情防空中就变得尤为重要... 详细信息

自2018年我国出现首例非洲猪瘟以来,疫情已波及31个省份,严重影响猪的生产性能,制约着经济的发展,对公共卫生安全造成了不可小觑的危害。目前,全球尚未出现行之有效的商品非洲猪瘟病毒疫苗。因此非洲猪瘟检测在疫情防空中就变得尤为重要,鉴于此,本研究建立了ASFV比色法环介导等温扩增检测方法,相应的建立了ASFV MGb探针法与之进行比较,获得以下结果:1.利用非洲猪瘟病毒B646L基因作为检测靶标,选取该基因的保守片段,针对该片段的6个靶点设计6条特异性引物,在对体系中内外引物浓度比例、镁离子浓度、d NTP浓度等各组分进行优化后,成功建立了非洲猪瘟病毒比色法环介导等温检测方法。利用该方法与猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV）、猪德尔塔冠状病毒（Porcine Delta Coronavirus,PDCo V）、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（High Pathogenicity Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,HPPRRSV）和猪伪狂犬病病毒（Pseudorabies Virus,PRV）等常见猪病病毒阳性参考品进行交叉反应实验,结果显示所建立的方法特异性良好。以已知浓度的阳性参考品进行10倍梯度稀释后作为反应模板,最低检测限可达10copies/μl,其灵敏度可与荧光定量PCR检测方法相媲美。2.同样的,以ASFV B646L基因保守区作为检测靶标,设计一对特异性引物及MGb探针,Probe 5’端用FAM荧光基团标记,3’端用MGb猝灭基团标记,建立了ASFV荧光定量PCR检测方法,并同上述常见猪病病毒阳性参考品进行交叉实验,结果显示该方法特异性良好,且最低检测限为6 copies/μl,灵敏度较lAMP而言更加灵敏,但就检测成本而言,lAMP比色法更胜一筹。3.本研究对lAMP结果判读进行不同方法的比对,分别利用SYbR Green I、Cresol Red、羟基柰酚蓝以及钙黄绿素进行终点显色对结果进行判读,结果显示,其灵敏性为SYbR Green I＞Cresol Red≥羟基柰酚蓝＞钙黄绿素,由于考虑到SYbR Green I会对扩增反应起到抑制作用,因此本研究所建立的方法采用了Cresol Red终点检测法,结果显示,该方法稳定性好,检测样品4℃放置3日后阳性样品显色仍保持稳定。

关键词：非洲猪瘟 B646L 环介导等温扩增比色法

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非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测方法的建立

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浙江农业科学 2023年第4期64卷 964-967页

作者：余斌徐丽华李军星苏菲叶十一袁秀芳浙江省农业科学院畜牧兽医研究所浙江杭州310021

为建立一种快捷高效的非洲猪瘟病毒(ASFV)的检测方法,本研究根据Genbank中登录的ASFV B646L基因保守区序列设计引物和探针,通过优化PCR反应体系和反应条件,建立了非洲猪瘟Taqman荧光定量(ASFV-qPCR)检测方法,验证其特异性、灵敏性和重... 详细信息

为建立一种快捷高效的非洲猪瘟病毒(ASFV)的检测方法,本研究根据Genbank中登录的ASFV B646L基因保守区序列设计引物和探针,通过优化PCR反应体系和反应条件,建立了非洲猪瘟Taqman荧光定量(ASFV-qPCR)检测方法,验证其特异性、灵敏性和重复性。结果显示:本研究所建立的检测方法特异性强,与猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)均无交叉反应;灵敏度高,能检出10拷贝阳性质粒DNA;重复性好,组内和组间重复试验变异系数均小于1.5%。本研究为非洲猪瘟快速诊断提供了有力技术支撑,为进一步开发ASFV多重荧光PCR检测技术奠定了坚实的基础。

关键词：非洲猪瘟病毒荧光定量PCR B646L 检测

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