非洲猪瘟病毒LAMP比色法和实时荧光PCR法的建立与比较

作     者：李永秀 

作者单位：河北科技师范学院 

学位级别：硕士

导师姓名：王秋悦;刘朋朋

授予年度：2021年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：非洲猪瘟 B646L 环介导等温扩增 比色法 

摘      要：自2018年我国出现首例非洲猪瘟以来,疫情已波及31个省份,严重影响猪的生产性能,制约着经济的发展,对公共卫生安全造成了不可小觑的危害。目前,全球尚未出现行之有效的商品非洲猪瘟病毒疫苗。因此非洲猪瘟检测在疫情防空中就变得尤为重要,鉴于此,本研究建立了ASFV比色法环介导等温扩增检测方法,相应的建立了ASFV MGB探针法与之进行比较,获得以下结果:1.利用非洲猪瘟病毒B646L基因作为检测靶标,选取该基因的保守片段,针对该片段的6个靶点设计6条特异性引物,在对体系中内外引物浓度比例、镁离子浓度、d NTP浓度等各组分进行优化后,成功建立了非洲猪瘟病毒比色法环介导等温检测方法。利用该方法与猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV）、猪德尔塔冠状病毒（Porcine Delta Coronavirus,PDCo V）、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（High Pathogenicity Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,HPPRRSV）和猪伪狂犬病病毒（Pseudorabies Virus,PRV）等常见猪病病毒阳性参考品进行交叉反应实验,结果显示所建立的方法特异性良好。以已知浓度的阳性参考品进行10倍梯度稀释后作为反应模板,最低检测限可达10copies/μL,其灵敏度可与荧光定量PCR检测方法相媲美。2.同样的,以ASFV B646L基因保守区作为检测靶标,设计一对特异性引物及MGB探针,Probe 5’端用FAM荧光基团标记,3’端用MGB猝灭基团标记,建立了ASFV荧光定量PCR检测方法,并同上述常见猪病病毒阳性参考品进行交叉实验,结果显示该方法特异性良好,且最低检测限为6 copies/μL,灵敏度较LAMP而言更加灵敏,但就检测成本而言,LAMP比色法更胜一筹。3.本研究对LAMP结果判读进行不同方法的比对,分别利用SYBR Green I、Cresol Red、羟基柰酚蓝以及钙黄绿素进行终点显色对结果进行判读,结果显示,其灵敏性为SYBR Green ICresol Red≥羟基柰酚蓝钙黄绿素,由于考虑到SYBR Green I会对扩增反应起到抑制作用,因此本研究所建立的方法采用了Cresol Red终点检测法,结果显示,该方法稳定性好,检测样品4℃放置3日后阳性样品显色仍保持稳定。