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Impeding the combination of astrocytic ASCT2 and NLRP3 by talniflumate alleviates neuroinflammation in experimental models of Parkinson's disease

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Acta Pharmaceutica Sinica B 2023年第2期13卷 662-677页

作者： Yang Liu Ting Liu Yuanzhang Zhou Wenjie Li Min Wang Nanshan Song Wenbin Zhang Jingwei Jiang Shengtao Yuan Jianhua Ding Gang Hu Ming Lu Jiangsu Key Laboratory of Neurodegeneration Department of PharmacologyNanjing Medical UniversityNanjing 211166China Department of Pharmacology School of Medicine and Holistic Integrative MedicineNanjing University of Chinese MedicineNanjing 210023China Department of Geriatrics Affiliated Brain Hospital of Nanjing Medical UniversityNanjing 210029China Department of Neurosurgery Affiliated Brain Hospital of Nanjing Medical UniversityNanjing 210029China Jiangsu Key Laboratory of Drug Screening China Pharmaceutical UniversityNanjing 211198China

Alanine-serine-cysteine transporter 2(ASCT2)is reported to participate in the progression of tumors and metabolic diseases.It is also considered to play a crucial role in the glutamate-glutamine shuttle of neuroglial network.However,it remains unclear the involvement of ASCT2 in neurological diseases such as Parkinson’s disease(PD).In this study,we demonstrated that high expression of ASCT2 in the plasma samples of PD patients and the midbrain of MPTP mouse models is positively correlated with dyskinesia.We further illustrated that ASCT2 expressed in astrocytes rather than neurons significantly upregulated in response to either MPP+or LPS/ATP challenge.Genetic ablation of astrocytic ASCT2 alleviated the neuroinflammation and rescued dopaminergic(DA)neuron damage in PD models in vitro and in vivo.Notably,the binding of ASCT2 to NLRP3 aggravates astrocytic inflammasometriggered neuroinflammation.Then a panel of 2513 FDA-approved drugs were performed via virtual molecular screening based on the target ASCT2 and we succeed in getting the drug talniflumate.It is validated talniflumate impedes astrocytic inflammation and prevents degeneration of DA neurons in PD models.Collectively,these findings reveal the role of astrocytic ASCT2 in the pathogenesis of PD,broaden the therapeutic strategy and provide a promising candidate drug for PD treatment.

关键词： ASCT2 NLRP3 Astrocytes Inflammation Neurodegeneration Drug screening Talniflumate Parkinson’s disease

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Inhibition of ASCT2 induces hepatic stellate cell senescence with modified proinflammatory secretome through an IL-1α/NF-κB feedback pathway to inhibit liver fibrosis

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Acta Pharmaceutica Sinica B 2022年第9期12卷 3618-3638页

作者： Feixia Wang Zhanghao Li Li Chen Ting Yang Baoyu Liang Zili Zhang Jiangjuan Shao Xuefen Xu Guoping Yin Shijun Wang Hai Ding Feng Zhang Shizhong Zheng Jiangsu Key Laboratory for Pharmacology and Safety Evaluation of Chinese Materia Medica School of PharmacyNanjing University of Chinese MedicineNanjing 210023China Department of General Surgery Nanjing Hospital Affiliated to Nanjing University of Chinese MedicineNanjing 210003China Department of Anesthesiology Nanjing Hospital Affiliated to Nanjing University of Chinese MedicineNanjing 210003China College of Traditional Chinese Medicine Shandong University of Traditional Chinese MedicineJinan 250035China

Senescence of activated hepatic stellate cells(aHSCs) is a stable growth arrest that is implicated in liver fibrosis regression.Senescent cells often accompanied by a multi-faceted senescence-associated secretory phenotype(SASP).But little is known about how alanine-serine-cysteine transporter type-2(ASCT2),a high affinity glutamine transporter,affects HSC senescence and SASP during liver fibrosis.Here,we identified ASCT2 is mainly elevated in aHSCs and positively correlated with liver fibrosis in human and mouse fibrotic livers.We first discovered ASCT2 inhibition induced HSCs to senescence in vitro and in vivo.The proinflammatory SASP were restricted by ASCT2 inhibition at senescence initiation to prevent paracrine migration.Mechanically,ASCT2 was a direct target of glutaminolysisdependent proinflammatory SASP,interfering IL-1α/NF-κB feedback loop via interacting with precursor IL-1α at Lys82.From a translational perspective,atractylenolide Ⅲ is identified as ASCT2 inhibitor through directly bound to Asn230 of ASCT2.The presence of -OH group in atractylenolide Ⅲ is suggested to be favorable for the inhibition of ASCT2.Importantly,atractylenolide Ⅲ could be utilized to treat liver fibrosis mice.Taken together,ASCT2 controlled HSC senescence while modifying the proinflammatory SASP.Targeting ASCT2 by atractylenolide Ⅲ could be a therapeutic candidate for liver fibrosis.

关键词： Hepatic stellate cells Senescence SASP ASCT2 Precursor IL-1α NF-κB Atractylenolide III Liver fibrosis

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白术内酯Ⅲ调控ASCT2介导的线粒体-溶酶体互作诱导肝星状细胞衰老的抗肝纤维化机制研究

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南京中医药大学学报 2024年第4期40卷 341-349页

作者：符秋雨王飞虾张峰郑仕中付金柏南京中医药大学药学院江苏南京210023 江苏省中医院药学部江苏南京210029

目的探究白术内酯Ⅲ诱导肝星状细胞(Hepatic stellate cell,HSC)衰老抗肝纤维化作用及机制。方法ASCT2 siRNA及白术内酯Ⅲ(40μmol·L^(-1))分别作用于人源肝星状细胞LX2以抑制ASCT2,MTT评估细胞活力,EdU法检测细胞增殖,细胞衰老β-半... 详细信息

目的探究白术内酯Ⅲ诱导肝星状细胞(Hepatic stellate cell,HSC)衰老抗肝纤维化作用及机制。方法ASCT2 siRNA及白术内酯Ⅲ(40μmol·L^(-1))分别作用于人源肝星状细胞LX2以抑制ASCT2,MTT评估细胞活力,EdU法检测细胞增殖,细胞衰老β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色检测细胞衰老;Western blot检测LX2细胞中LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的变化,激光共聚焦检测LC3自噬流和错误蛋白堆积的变化,同时观察溶酶体标记物LAMP1的荧光情况,以检测溶酶体功能和数量;试剂盒检测LX2细胞内ROS、MDA水平及SOD活力,流式细胞术分析线粒体ROS水平及膜电位。构建CCl 4诱导的小鼠肝纤维化模型,白术内酯Ⅲ20、30、40 mg·kg^(-1)治疗性给药,HE、Masson和Sirius Red染色观察肝脏组织破坏以及胶原沉积情况,Western blot检测各组小鼠P21、P16表达水平,SA-β-Gal染色以及免疫组化分析衰老细胞的情况和来源。结果抑制ASCT2后,LX2细胞活力降低、衰老增加(PASCT2后,LX2细胞内MDA、ROS水平上升,SOD活力下降(P21的表达(PASCT2诱导线粒体ROS增多、膜电位下降,进一步促进HSC自噬功能增强、溶酶体数量增多和功能减弱,从而诱导活化型HSC发生衰老。

关键词：白术内酯Ⅲ ASCT2 肝星状细胞衰老肝纤维化谷氨酰胺代谢

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谷氨酰胺转运蛋白ASCT2的研究进展

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中国药理学通报 2020年第1期36卷 22-25页

作者：梁宝瑜金春高俪原李余佳王桭屹张峰郑仕中

谷氨酰胺在细胞蛋白质和能量代谢中起着核心作用。谷氨酰胺必需通过细胞膜上特异性载体的转运才能进入细+胞内发挥作用,其中Na依赖性谷氨酰胺载体2(alanine-serine-cysteine transporter2,ASCT2)最为重要。ASCT2不仅在正常组织器官中广... 详细信息

谷氨酰胺在细胞蛋白质和能量代谢中起着核心作用。谷氨酰胺必需通过细胞膜上特异性载体的转运才能进入细+胞内发挥作用,其中Na依赖性谷氨酰胺载体2(alanine-serine-cysteine transporter2,ASCT2)最为重要。ASCT2不仅在正常组织器官中广泛表达,而且在肿瘤中的表达明显增加,以满足肿瘤急剧增加的谷氨酰胺需求。ASCT2生物学功能的调控与人类健康密切相关。ASCT2的N糖基化位点是N163和N212,对ASCT2转运到膜上至关重要,但对ASCT2的内在转运功能影响不大。ASCT2与其他蛋白间的相互作用和翻译后修饰对ASCT2的稳定性、转运活性具有重要调节作用。该文主要总结ASCT2生物学功能调控及其对疾病治疗的意义。

关键词：谷氨酰胺 ASCT2 转运蛋白代谢调控抑制剂

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shRNA干扰ASCT2基因表达对结肠癌细胞生物学行为的影响

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中华胃肠外科杂志 2017年第4期20卷 450-454页

作者：蔡灿锋曾兵曾军辛海洋唐超明广州医科大学附属第六医院胃肠外科广东省清远市人民医院胃肠外科 510120

目的探讨shRNA下调谷氨酰胺转运体ASCT2对结肠癌细胞Lovo和SW480生物学行为的影响。方法利用Lipofectamine2000介导ASCT2-shRNA的表达载体转染结肠癌细胞Lovo和SW480，通过反转录PCR和western blot分别检测转染后ASCT2mRNA及蛋白的表达... 详细信息

目的探讨shRNA下调谷氨酰胺转运体ASCT2对结肠癌细胞Lovo和SW480生物学行为的影响。方法利用Lipofectamine2000介导ASCT2-shRNA的表达载体转染结肠癌细胞Lovo和SW480，通过反转录PCR和western blot分别检测转染后ASCT2mRNA及蛋白的表达情况：分别应用MTY法和transwell法检测其结肠癌细胞增殖和侵袭能力；应用放射示踪法检测结肠癌细胞对谷氨酰胺的摄取情况。结果shASCT2转染后，Lovo和SW480细胞中ASCT2mRNA及蛋白水平均显著下调（P〈0．01）。shASCT2转染后，Lovo和SW480细胞增殖能力（A490）和细胞侵袭能力（透膜细胞数）均较对照组细胞显著减弱（均P〈0．01）；其中Lovo细胞中实验组和对照组的透膜细胞数分别为46．3±5．9和197，7±9．1，SW480细胞中实验组和对照组的透膜细胞数分别为29．7±3．8和139．0±9．5。放射示踪法检测显示，shASCT2转染后，Lovo和SW480细胞对谷氨酰胺的摄取受到显著抑制，其中，对Lzvo细胞的抑制率为79．15％，对SW480的抑制率为67．22％，差异均有统计学意义（均P〈0．01）。结论ASCT2在结肠癌中发挥癌基因的作用，其促进结肠癌进展的机制可能与谷氨酰胺代谢有关．有望成为肿瘤代谢治疗的重要靶点。

关键词：结肠肿瘤基因 ASCT2 谷氨酰胺代谢生物学行为

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谷氨酰胺转运载体ASCT2在肿瘤中的研究进展

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肿瘤防治研究 2019年第3期46卷 266-270页

作者：王雅乐黄承浩厦门大学国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心/分子疫苗学和分子诊断学国家重点实验室厦门361102

肿瘤细胞具有独特的代谢需求,其代谢过程需要消耗大量的谷氨酰胺。谷氨酰胺与肿瘤细胞的增殖密切相关,它可以调节细胞的存活、代谢、信号转导、自噬等。丙氨酸-丝氨酸-半胱氨酸转运载体2(alanine-serine-cysteine transporter 2, ASCT2)... 详细信息

肿瘤细胞具有独特的代谢需求,其代谢过程需要消耗大量的谷氨酰胺。谷氨酰胺与肿瘤细胞的增殖密切相关,它可以调节细胞的存活、代谢、信号转导、自噬等。丙氨酸-丝氨酸-半胱氨酸转运载体2(alanine-serine-cysteine transporter 2, ASCT2)是Na^+依赖性的,主要通过跨膜转运谷氨酰胺及一些大分子中性氨基酸。ASCT2在许多肿瘤细胞中都是过度表达的,且ASCT2的高表达与肿瘤患者的不良预后呈正相关。目前国外已将谷氨酰胺的代谢和转运载体作为治疗靶标,进行抗肿瘤新药的研发,但国内对谷氨酰胺转运载体的相关研究报道较少,故本文就ASCT2的结构、表达及在肿瘤中的作用等作一综述。

关键词：谷氨酰胺转运载体 ASCT2 肿瘤

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敲低ASCT2抑制肝细胞癌细胞线粒体代谢和肿瘤进展

敲低ASCT2抑制肝细胞癌细胞线粒体代谢和肿瘤进展

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作者：于淑琦安徽医科大学

学位级别：硕士

【研究背景】肝细胞癌（HCC）是全球高发癌症,是世界排名第六位的常见癌症,也是造成癌症相关死亡的重要因素。由于大多数HCC患者早期缺乏特异性的、明显的症状,许多患者确诊时,病情已处于晚期,难以治愈。虽然目前的治疗手段有通过手术... 详细信息

【研究背景】肝细胞癌（HCC）是全球高发癌症,是世界排名第六位的常见癌症,也是造成癌症相关死亡的重要因素。由于大多数HCC患者早期缺乏特异性的、明显的症状,许多患者确诊时,病情已处于晚期,难以治愈。虽然目前的治疗手段有通过手术切除肝癌组织、移植功能状态良好的肝、射频消融术、放化疗等,且在临床上已被广泛采用,但仍有很多患者在接受治疗后容易复发和转移,这提示目前的治疗手段存在一定的不足。代谢改变是肿瘤发生的主要标志之一,癌细胞对其特定营养物质有着很强的依赖,而且其各种代谢相关基因也有改变,这些都可能成为癌症治疗时的着手点。准确的说,肿瘤细胞绝大多数生命活动的正常进行都需要大量的能量即ATP来给予支持。那么肿瘤细胞合成生物大分子所需要的ATP的主要产生来源是什么呢?关于癌细胞的内部的能量代谢,目前有几大理论。第一个是经典的Warburg效应,它解释了癌细胞通过糖酵解途径进行代谢,将葡萄糖发酵作为产生ATP的来源。Warburg认为,葡萄糖是通过发酵而不是氧化呼吸作用,来代谢生成癌细胞生长所需的能量。到目前为止,人们依旧普遍认为葡萄糖是癌细胞中代谢生成ATP的主要底物来源。然而,这种情况只发生在当葡萄糖是缺氧条件下唯一的营养底物时。第二个理论是癌细胞新陈代谢理论,它认为,肿瘤细胞是通过复杂的共生关系生存的:一个癌细胞先是利用葡萄糖产生乳酸和ATP（Warburg效应）,之后它周围邻近的癌细胞,可以利用它代谢过程中产生的乳酸,通过三羧酸循环（TCA）以及氧化磷酸化代谢生成ATP。一些癌细胞则是利用乳酸作为TCA中间体的底物,然后通过单羧酸转运体,参与ATP的生成。经过乳酸脱氢酶（LDH）和柠檬酸裂解酶的作用,乳酸还能够参与脂肪酸的合成。因此,癌细胞的共生理论可能对癌细胞中生物大分子的合成比ATP的生成发挥着更重要的作用。第三种理论则是谷氨酰胺通过代谢转化生成谷氨酸,之后再通过谷氨酸脱氢酶的作用,生成α-酮戊二酸（α-KG）。之后α-KG通过TCA循环,来驱动ATP的合成,这意味着谷氨酰胺也可以作为生成ATP的原料。而且近年来,关于谷氨酰胺在代谢中发挥的作用的研究愈发受到重视,目前的研究结果表明,谷氨酰胺是一种特殊的氨基酸,属于一组有条件必需氨基酸,特别是在应激环境下需要快速大量分解代谢时,如在术后、损伤或脓毒症这几种情况下,肾脏、胃肠道等的谷氨酰胺的消耗量将急剧上升。肠粘膜细胞对谷氨酰胺的依赖特别强,当在谷氨酰胺耗尽后,细胞将会迅速坏死。在快速分裂的细胞中,特别是癌细胞中,谷氨酰胺也是被大量地消耗和利用以用来产生能量,并作为碳和氮的来源。如果缺乏谷氨酰胺,一些癌细胞就无法正常生存,甚至会死亡,而且进展速度很快。这些研究结果反映了谷氨酰胺对癌细胞的增殖和生存有着非常重要的作用。谷氨酰胺本身可以促进核苷酸合成和尿苷二磷酸N-乙酰氨基葡萄糖的合成,以用来支持蛋白质的折叠和转运。通过谷氨酰胺酶的作用,谷氨酰胺还能转化为谷氨酸。谷氨酸可以促进谷胱甘肽的合成,其中,谷胱甘肽是一种由半胱氨酸、谷氨酸和甘氨酸组成的三肽,在维持细胞内的氧化还原稳态中扮演着重要的角色。靶向癌细胞的氧化还原代谢,可以导致细胞内活性氧（ROS）累积水平升高,历史上,ROS被认为是细胞呼吸和蛋白质折叠的致命代谢副产物。低水平的ROS,可以调节细胞增殖以及适应代谢应激,而随着ROS水平的升高,细胞死亡信号通路启动,会对细胞造成损伤,可以造成细胞线粒体膜结构的破坏,使细胞氧化损伤,影响线粒体代谢,甚至导致细胞死亡。谷氨酰胺需要通过转运体如丙氨酸-丝氨酸-半胱氨酸转运蛋白2（ASCT2）进入哺乳动物细胞。肿瘤微环境中的细胞代谢受其所处的营养条件以及肿瘤细胞和基质细胞之间活跃的信号交流和代谢物交换的影响。同样的,相对于营养物质,营养物质转运载体在促进肿瘤细胞的动态代谢中也扮演着重要的角色。在一些生长速度较快的细胞中,ASCT2的表达水平上调,用来满足细胞升高的对于谷氨酰胺高度依赖的需求。有趣的是,出于同样的能量需求原因,ASCT2在许多癌症中的表达水平也大幅度提升。我们课题组的前期研究结果显示,与正常肝细胞HL-02相比,Hep G2、Hep3B、SMMC-7721、BEL-7404、QGY-7701这些HCC细胞中ASCT2表达水平明显升高。这些研究结果提出一个有意义的猜想:ASCT2是否可以作为HCC治疗的潜在靶点?【研究方法】1.选取SMMC-7721及BEL-7404这两种高表达ASCT2的细胞,通过慢病毒转染敲低ASCT2在细胞中的表达,观察荧光的表达即转染效率,然后用嘌呤霉素进行药物筛选以获得转染后的细胞,建立稳定细胞系,然后利用Western bolt验证慢病毒转染后的ASCT2敲低效果。2.利用ROS试剂盒检测ASCT2敲低后是否对HCC细胞内的氧化还原稳态有影响。3.利用裸鼠成瘤实验检测ASCT2敲低后是否对HCC细胞在裸鼠体内的成瘤能力有影响。4.利用seah

关键词： ASCT2 肝细胞癌活性氧线粒体代谢

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谷氨酰胺转运体ASCT2介导激活突变Ptpn11（Shp2）促进骨髓增生性肿瘤和白血病的发生

谷氨酰胺转运体ASCT2介导激活突变Ptpn11（Shp2）促进骨髓增生性...

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作者：马牧天安徽医科大学

学位级别：硕士

研究背景骨髓增殖性肿瘤(Myeloproliferative neoplasma,MPN)是一类造血干细胞克隆性疾病,是一类以一系或多系细胞持续异常增殖为特征的血液系统疾病,常见的MPN包括慢性粒细胞性白血病、真性红细胞增多症(Polycythel1lia vera,PV)、原... 详细信息

研究背景骨髓增殖性肿瘤(Myeloproliferative neoplasma,MPN)是一类造血干细胞克隆性疾病,是一类以一系或多系细胞持续异常增殖为特征的血液系统疾病,常见的MPN包括慢性粒细胞性白血病、真性红细胞增多症(Polycythel1lia vera,PV)、原发性血小板增多症(Essential thmmbocvthemia,ET)、原发性骨髓纤维化;较少见的MPN包括慢性中性粒细胞白血病、慢性嗜酸粒细胞白血病、系统性肥大细胞增多症及其他未分类疾病(骨髓增殖特性的一些骨髓恶性肿瘤,如慢性骨髓系白血病和非典型慢性髓细胞性白血病)。患者临床表现为髓外造血(可导致脾肿大)、贫血、白细胞异常增多、骨髓纤维变性等症状,在病理后期可转化为急性白血病。目前临床针对MPN尚无有效的治疗手段,对患者主要采用支持疗法,目的是降低过高的白细胞数或脾大,但并不能延长患者寿命,也难以有效改善其全身症状。所以积极探讨骨髓增殖性肿瘤包括白血病等难治性血液系统疾病的发病机制并寻找有效的治疗靶点仍然是我们亟待解决的难题。蛋白质酪氨酸磷酸酶2(SHP2)是一种由Ptpn11基因编码的一种非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶,参与多种信号通路转导过程的激活,已经被证实在多种癌症的发生发展过程中起到关键性作用;并且SHP2蛋白多见于各种造血细胞中,在造血细胞的生长发育、增殖分化过程中起着十分重要的作用。SHP2蛋白的突变被认为是白血病,尤其是青少年粒单细胞白血病(Juvenile myelomonocytic leukemia,JMML),儿童骨髓增殖性肿瘤(Juvenile myeloproliferative neoplasm,MPN)的高危因素,因其在多种类型白血病中均存在着异常突变和活化的现象,因此也被认为可能是白血病的原癌基因。氨基酸转运载体2(Amino-acid Transporter 2,ASCT2)是一种由Slc1a5基因编码的中性氨基酸载体,主要转运谷氨酰胺、丝氨酸、丙氨酸和半胱氨酸等,其中经由其转运进入细胞内的谷氨酰胺不仅作为反应底物参与细胞内的三羧酸循环,为细胞生长提供能量,同时其降解产物还能为细胞提供生命合成必要的氮源,对处于快速增殖状态的癌细胞起着至关重要的作用。ASCT2的高表达已被证实在诸如三阴性乳腺癌,子宫内膜癌等多种癌症的发生发展过程中起到关键作用,抑制ASCT2的表达则可有效的抑制癌细胞的恶性增殖。虽然目前科学界对谷氨酰胺载体ASCT2的生理学功能进行了大量的研究,然而,病理情况下,尤其是在血液系统肿瘤中的调控作用,研究不多。而有关ASCT2在SHP2激活突变后的疾病发病机制中的作用至今未见报道,因此,本研究拟采用SHP2激活突变的小鼠模型,探索ASCT2蛋白对SHP2激活突变后致骨髓增殖性肿瘤及白血病的影响,并且使用ASCT2抑制剂(GPNA)观察其能否抑制骨髓增殖性肿瘤及白血病的发病进程。研究方法1.选用C57BL/6J(Mx1-Cre)小鼠和C57BL/6J(Ptpn11)小鼠配繁,构建Ptpn11/Mx1-Cre激活突变鼠。2.通过流式细胞技术分离正常小鼠和突变鼠HSCs和MSCs,并体外培养。3.通过Western-Blot技术对比分析ASCT2和p-m TOR、、p-ERK、p-AKT、p-S6等细胞增殖和能量代谢相关蛋白的表达。4.检测两组小鼠细胞和血清中谷氨酰胺和支链氨基酸的含量。5.通过腹腔注射ASCT2抑制剂(GPNA)构建ASCT2低表达的突变鼠模型。6.通过Western-Blot等技术分析比较突变鼠和药物处理组ASCT2表达、细胞增殖和能量代谢相关指标的变化。实验研究结果1.成功构建Ptpn11/Mx1-Cre激活突变鼠MPN模型。2.突变鼠比正常小鼠的ASCT2表达增高,突变鼠间充质干细胞增殖能力增强p-m TOR、p-ERK、p-AKT、p-S6等细胞信号分子表达增强。3.突变鼠骨髓间充质干细胞及血清中谷氨酸盐含量明显较高。4.ASCT2抑制剂处理Ptpn11/Mx1-Cre突变鼠后,小鼠脾脏较未处理组缩小,骨髓细胞谷氨酸含量明显较低,AKT/m TOR信号通路活性被抑制,显示抑制ASCT2后,骨髓增殖性肿瘤及白血病的发病进展受阻。结论ASCT2的表达量与SHP2激活突变后致骨髓增殖性肿瘤及白血病的发病进程息息相关,抑制ASCT2活化后能够降低MPN和白血病细胞对谷氨酰胺的摄取能力,有效的抑制SHP2突变型骨髓增殖性肿瘤及白血病的发病进程。显示ASCT2可能是治疗该类型疾病的有效靶点。

关键词： ASCT2 Ptpn11 白血病 SHP2突变 GPNA

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O-GlcNAcylation Coordinates Glutaminolysis by Regulating the Stability and Membrane Trafficking of ASCT2 in Hepatic Stellate Cells

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Journal of Clinical and Translational Hepatology 2022年第6期10卷 1107-1116页

作者： Feixia Wang Li Chen Biyun Zhang Zhanghao Li Min Shen Li Tang Zili Zhang Jiangjuan Shao Feng Zhang Shizhong Zheng Shanzhong Tan Department of Integrated TCM and Western Medicine Nanjing Hospital Affiliated to Nanjing University of Chinese MedicineNanjingJiangsuChina Jiangsu Key Laboratory for Pharmacology and Safety Evaluation of Chinese Materia Medica Nan-jing University of Chinese MedicineNanjingJiangsuChina Department of Nuclear Medicine Jiangsu Province Hospital of Chinese MedicineAffiliated Hospital of Nanjing University of Chinese MedicineNanjingJiangsuChina

Background and Aims:Recognition of excessive activa-tion of hepatic stellate cells(HSCs)in liver fibrosis prompt-ed us to investigate the regulatory mechanisms of HSCs.We aimed to examine the role of O-GlcNAcylation modifica-tion of alanine,serine,cysteine transporter 2(ASCT2)in HSCs and liver fibrosis.Methods:The expression of O-Glc-NAcylation modification in fibrotic mice livers and activated HSCs was analyzed by western blotting.Immunoprecipita-tion was used to assess the interaction of ASCT2 and O-Glc-NAc transferase(OGT).In addition,ASCT2 protein stability was assayed after cycloheximide(CHX)treatment.The O-GlcNAcylation site of ASCT2 was predicted and mutated by site-directed mutagenesis.Real-time PCR,immunofluores-cence,kit determinations and Seahorse assays were used to clarify the effect of ASCT2 O-GlcNAcylation on HSC glu-taminolysis and HSC activation.Western blotting,immuno-chemistry,and immunohistofluorescence were used to ana-lyze the effect of ASCT2 O-GlcNAcylation in vivo.Results:We observed significantly increased O-GlcNAcylation modi-fication of ASCT2.ASCT2 was found to interact with OGT to regulate ASCT2 stability.We predicted and confirmed that O-GlcNAcylation of ASCT2 at Thr122 site resulted in HSCs activation.We found Thr122 O-GlcNAcylation of ASCT2 me-diated membrane trafficking of glutamine transport and attenuated HSC glutaminolysis.Finally,we validated the expression and function of ASCT2 O-GlcNAcylation after in-jection of AAV8-ASCT2 shRNA in CCl4-induced liver fibrosis mice in vivo.Conclusions:Thr122 O-GlcNAcylation regu-lation of ASCT2 resulted in stability and membrane traf-ficking-mediated glutaminolysis in HSCs and liver fibrosis.Further studies are required to assess its role as a putative therapeutic target.

关键词： ASCT2 O-GlcNacylation Stability Trafficking Liver fibrosis

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ASCT2对肝癌细胞恶性生物学行为的影响及其机制

ASCT2对肝癌细胞恶性生物学行为的影响及其机制

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作者：张诗童安徽医科大学

学位级别：硕士

【研究背景】肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是全球患病人数最多的癌症之一,是全球第五致死癌症。慢性乙型肝炎,丙型肝炎或酒精中毒引起的肝硬化是HCC发病的主要危险因素,其次是非酒精性脂肪性肝炎。HCC是多种危险因素导致的... 详细信息

【研究背景】肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是全球患病人数最多的癌症之一,是全球第五致死癌症。慢性乙型肝炎,丙型肝炎或酒精中毒引起的肝硬化是HCC发病的主要危险因素,其次是非酒精性脂肪性肝炎。HCC是多种危险因素导致的多因素疾病,危险因素包括乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒的感染、黄曲霉素B1的摄入、酗酒、吸烟,以及宿主因素例如肝硬化、非酒精性脂肪肝等。HCC的发展不仅与外在环境因素有关还与基因组的改变相关。相对于其他人类恶性实体肿瘤,HCC具有极高的迁移以及侵袭能力。氨基酸代谢异常被认为是恶性肿瘤的一大显著特征。有的观点认为恶性肿瘤其实就是一种代谢性疾病。其中,较高的谷氨酰胺代谢参与肿瘤的发生与发展。因为肿瘤细胞的高消耗,所以需要摄取较多的谷氨酰胺,而高通量的谷氨酰胺转运则需要借助细胞膜上的氨基酸转运载体才能实现,这时肿瘤细胞就会通过高表达谷氨酰胺特异性氨基酸转运载体来实现谷氨酰胺的高摄取。ASCT2,又称SLC1A5(Solute Carrier Family 1 Member 5)是细胞膜针对谷氨酰胺的特异性氨基酸转运蛋白,可以介导谷氨酰胺向细胞内的转运。虽然谷氨酰胺是非必需氨基酸,但缺乏谷氨酰胺会对细胞造成影响。在肿瘤细胞中,其对谷氨酰胺的需求较正常细胞显著增加,谷氨酰胺用于产生大量的ATP以及合成蛋白,用来满足肿瘤细胞高代谢的需求。通过抑制ASCT2蛋白来减少谷氨酰胺的摄入,从而抑制肿瘤细胞的恶性生物学,已经在胃癌、乳腺癌、急性白血病中得到有效的证明,所以ASCT2将会是新的肿瘤治疗的靶点。【研究方法】1.首先检测了5株肝癌细胞系及正常肝细胞系的ASCT2 mRNA和蛋白的表达情况,在Oncomine数据库中找到ASCT2在肝细胞癌及正常肝组织中的表达情况并做统计学分析。2.选取SMMC-7721细胞株和BEL-7404细胞株,通过慢病毒系统敲低ASCT2,在荧光倒置显微镜下观察荧光检测其转染效率,通过Western bolt检测ASCT2的敲低效果,用嘌呤霉素药筛细胞建立稳定细胞株。3.通过平板克隆和MTT实验检测ASCT2的敲低是否影响肝癌细胞的增殖能力;通过migration、invasion实验检测ASCT2敲低后是否影响肝癌细胞的迁移和侵袭能力。4、利用Western blot检测在ASCT2敲低后AKT/mTOR信号通路的表达变化。【研究结果】1.5株肝癌细胞系ASCT2 mRNA和蛋白相对于正常肝细胞系都表达较高。在Oncomine数据库中获得临床数据并进行数据分析,临床肝癌组织样本中的ASCT2的表达高于正常肝组织。2.在荧光倒置显微镜下观察,SMMC-7721细胞和BEL-7404细胞带有荧光的细胞数接近100%。通过Western bolt检测,7721-ASCT2-inhibitor组和7404-ASCT2-inhibitor组较其NC组的ASCT2蛋白表达显著降低。3.平板克隆和MTT实验检测结果显示ASCT2的敲低对SMMC-7721细胞和BEL-7404细胞的增殖能力有显著抑制。migration、invasion实验检测结果指出,ASCT2的敲低可以显著抑制SMMC-7721细胞和BEL-7404细胞的迁移和侵袭能力。4.在机制方面,利用Western blot检测在ASCT2敲低后,p-AKT和mTOR的表达明显降低。表明ASCT2的表达变化影响了细胞内AKT/mTOR信号通路。【结论】1.ASCT2在肝癌细胞系以及肝癌组织中的表达明显高于正常肝细胞及肝组织。2.ASCT2的表达抑制通过影响细胞内AKT/mTOR信号通路来抑制肝癌细胞的恶性行为学。

关键词：肝细胞癌 ASCT2 增殖迁移侵袭

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