ASCT2对肝癌细胞恶性生物学行为的影响及其机制

作     者：张诗童 

作者单位：安徽医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：倪芳

授予年度：2019年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：肝细胞癌 ASCT2 增殖 迁移 侵袭 

摘      要：【研究背景】肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是全球患病人数最多的癌症之一,是全球第五致死癌症。慢性乙型肝炎,丙型肝炎或酒精中毒引起的肝硬化是HCC发病的主要危险因素,其次是非酒精性脂肪性肝炎。HCC是多种危险因素导致的多因素疾病,危险因素包括乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒的感染、黄曲霉素B1的摄入、酗酒、吸烟,以及宿主因素例如肝硬化、非酒精性脂肪肝等。HCC的发展不仅与外在环境因素有关还与基因组的改变相关。相对于其他人类恶性实体肿瘤,HCC具有极高的迁移以及侵袭能力。氨基酸代谢异常被认为是恶性肿瘤的一大显著特征。有的观点认为恶性肿瘤其实就是一种代谢性疾病。其中,较高的谷氨酰胺代谢参与肿瘤的发生与发展。因为肿瘤细胞的高消耗,所以需要摄取较多的谷氨酰胺,而高通量的谷氨酰胺转运则需要借助细胞膜上的氨基酸转运载体才能实现,这时肿瘤细胞就会通过高表达谷氨酰胺特异性氨基酸转运载体来实现谷氨酰胺的高摄取。ASCT2,又称SLC1A5(Solute Carrier Family 1 Member 5)是细胞膜针对谷氨酰胺的特异性氨基酸转运蛋白,可以介导谷氨酰胺向细胞内的转运。虽然谷氨酰胺是非必需氨基酸,但缺乏谷氨酰胺会对细胞造成影响。在肿瘤细胞中,其对谷氨酰胺的需求较正常细胞显著增加,谷氨酰胺用于产生大量的ATP以及合成蛋白,用来满足肿瘤细胞高代谢的需求。通过抑制ASCT2蛋白来减少谷氨酰胺的摄入,从而抑制肿瘤细胞的恶性生物学,已经在胃癌、乳腺癌、急性白血病中得到有效的证明,所以ASCT2将会是新的肿瘤治疗的靶点。【研究方法】1.首先检测了5株肝癌细胞系及正常肝细胞系的ASCT2 mRNA和蛋白的表达情况,在Oncomine数据库中找到ASCT2在肝细胞癌及正常肝组织中的表达情况并做统计学分析。2.选取SMMC-7721细胞株和BEL-7404细胞株,通过慢病毒系统敲低ASCT2,在荧光倒置显微镜下观察荧光检测其转染效率,通过Western bolt检测ASCT2的敲低效果,用嘌呤霉素药筛细胞建立稳定细胞株。3.通过平板克隆和MTT实验检测ASCT2的敲低是否影响肝癌细胞的增殖能力;通过migration、invasion实验检测ASCT2敲低后是否影响肝癌细胞的迁移和侵袭能力。4、利用Western blot检测在ASCT2敲低后AKT/mTOR信号通路的表达变化。【研究结果】1.5株肝癌细胞系ASCT2 mRNA和蛋白相对于正常肝细胞系都表达较高。在Oncomine数据库中获得临床数据并进行数据分析,临床肝癌组织样本中的ASCT2的表达高于正常肝组织。2.在荧光倒置显微镜下观察,SMMC-7721细胞和BEL-7404细胞带有荧光的细胞数接近100%。通过Western bolt检测,7721-ASCT2-inhibitor组和7404-ASCT2-inhibitor组较其NC组的ASCT2蛋白表达显著降低。3.平板克隆和MTT实验检测结果显示ASCT2的敲低对SMMC-7721细胞和BEL-7404细胞的增殖能力有显著抑制。migration、invasion实验检测结果指出,ASCT2的敲低可以显著抑制SMMC-7721细胞和BEL-7404细胞的迁移和侵袭能力。4.在机制方面,利用Western blot检测在ASCT2敲低后,p-AKT和mTOR的表达明显降低。表明ASCT2的表达变化影响了细胞内AKT/mTOR信号通路。【结论】1.ASCT2在肝癌细胞系以及肝癌组织中的表达明显高于正常肝细胞及肝组织。2.ASCT2的表达抑制通过影响细胞内AKT/mTOR信号通路来抑制肝癌细胞的恶性行为学。