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中国免疫学杂志 2022年第7期38卷 769-776,782页

作者：蔡玉荣王媛孔云逸曾瑾王娟高蔚丰李勇(指导) 宁夏大学西部生物资源保护与利用教育部重点实验室银川750021 宁夏大学生命科学学院银川750021

目的:研究在结核分枝杆菌(MTB)感染肺泡Ⅱ型上皮细胞(aecⅡ)过程中,p53和NF-κB信号通路中相关信号分子是否参与了抗结核的先天免疫调控。方法:利用实时荧光定量PCR、Western blot和蛋白芯片技术,通过过表达和抑制aecⅱ细胞中的p53和NF-... 详细信息

目的:研究在结核分枝杆菌(MTB)感染肺泡Ⅱ型上皮细胞(aecⅡ)过程中,p53和NF-κB信号通路中相关信号分子是否参与了抗结核的先天免疫调控。方法:利用实时荧光定量PCR、Western blot和蛋白芯片技术,通过过表达和抑制aecⅱ细胞中的p53和NF-κB基因,分析在牛结核分枝杆菌弱毒株卡介苗(BCG)感染过程中p53和NF-κB信号通路的信号分子和细胞炎症因子的表达变化,并探讨p53与NF-κB信号通路在aecⅱ细胞抗MTB感染免疫应答中的“cross-talk”关系。结果:在A549细胞中,p53信号通路通过p53协同CBP来负调控NF-κB、TLR-4及TRAF6的表达,从而抑制NF-κB信号通路的活化,并上调IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-γ的表达;而NF-κB信号通路通过NF-κB协同TLR-4、TRAF6与CBP来负调控p53与MDM2的表达,从而抑制p53信号通路的激活,同时上调了IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-γ的表达。当BCG感染A549细胞时,p53信号通路中p53协同MDM2负调控CBP,进而上调NF-κB信号通路的TLR-4和TRAF6;同时,NF-κB信号通路通过TLR-4和TRAF6协同MDM2、CBP活化p53信号通路;细胞炎症因子IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-γ的表达均显著上调。结论:在aecⅱ细胞中p53信号通路与NF-κB信号通路间存在拮抗作用;当受到BCG刺激时,p53信号通路与NF-κB信号通路表现出协同参与aecⅱ细胞抗MTB感染的免疫调控作用,本研究为深入探讨p53和NF-κB信号通路在肺泡上皮细胞抗结核中的免疫调控机制提供了理论参考。

关键词：结核分枝杆菌 aecⅱ细胞 p53 NF-κB 免疫调控

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大鼠原代aecⅱ细胞中突变型FGF受体胞外段抑制肺纤维化的机制研究

大鼠原代AECⅡ细胞中突变型FGF受体胞外段抑制肺纤维化的机制研究

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作者：宋荣英暨南大学

学位级别：硕士

本论文主要通过体外试验和体内试验研究了突变型可溶性FGFR2c胞外段(Mutant soluble ectodomain of fibroblast growth factor receptor 2 IIIc,msFGFR2c)对肺纤维化的抑制作用及相关机制。首先,通过体内外试验探究成纤维细胞生长因子(F... 详细信息

本论文主要通过体外试验和体内试验研究了突变型可溶性FGFR2c胞外段(Mutant soluble ectodomain of fibroblast growth factor receptor 2 IIIc,msFGFR2c)对肺纤维化的抑制作用及相关机制。首先,通过体内外试验探究成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factor,FGF)信号对肺纤维化过程的作用机制。通过Western blot试验发现了成纤维细胞MRC-5的条件性培养基(Conditional medium,以下简称为Medium)诱导II型肺泡上皮细胞(Type II alveolar epithelial cells,aecⅡ)后,神经-钙粘素(N-cadherin)、结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor,CTGF)及Alpha–平滑肌肌动蛋白(Alpha-smooth muscle actin,α-SMA)表达明显上调。细胞体外侵袭实验(Trans-well)验证了Medium诱导后,aecⅱ细胞迁移明显增加并且可以被Anti-CTGF和msFGFR2c抑制。酶联免疫吸附试验(Enzyme linked-immuno-sorbent assay,ELISA)试验显示Medium中转化生长因子-beta(Transforming growth factor-β,TGF-β)及FGF-2含量明显上调,暗示着TGF-β和FGF-2在肺纤维化过程中发挥重要作用。ELISA试验显示TGF-β能够诱导aecⅱ细胞FGF-2的释放。实时荧光定量PCR试验(RT-PCR)结果表明TGF-β或CTGF可以诱导aecⅱ细胞向FGFR2c亚型转变。由于FGFR2c亚型受体是FGF-2最适受体之一,FGF-2可作用于aecⅡ型细胞并参与到纤维化过程中。免疫印迹实验(Western blot)结果表明TGF-β与msFGFR2c共同作用时aecⅱ细胞中α-SMA表达明显下调。这表明FGF-2可通过自分泌方式参与到TGF-β诱导的纤维化过程,并且此过程可以被msFGFR2c抑制。最后体内试验结果表明,建立博来霉素诱导的C57BL/6小鼠肺纤维化模型,小鼠的存活率、肺组织苏木精-伊红染色(Hematoxylin-eosin staining,HE)及Massion染色结果都表明msFGFR2c对肺纤维化有明显的抑制作用,验证了FGF信号参与肺纤维化过程的机制。

关键词：肺纤维化 aecⅱ细胞 CTGF msFGFR2c FGF-2 博莱霉素

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miRNA-26a影响肺表面活性物质合成的机制研究

miRNA-26a影响肺表面活性物质合成的机制研究

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作者：张颖慧南京医科大学

学位级别：硕士

新生儿呼吸窘迫综合症(respiratory distress syndrome,RDS)是新生儿期常见危重症之一,有较高的发病率和病死率,严重影响早产新生儿的生存质量及预后,其发生发展的关键环节是由于肺表面活性物(pulmonary surfactant,PS)的相对或绝对不足... 详细信息

新生儿呼吸窘迫综合症(respiratory distress syndrome,RDS)是新生儿期常见危重症之一,有较高的发病率和病死率,严重影响早产新生儿的生存质量及预后,其发生发展的关键环节是由于肺表面活性物(pulmonary surfactant,PS)的相对或绝对不足。PS由Ⅱ型肺泡上皮细胞(aecⅡ)合成与分泌的,其作用为降低肺表面张力、增加肺的顺应性,从而维持肺泡完整性。本论文主要目的是研究新生儿呼吸窘迫综合症的发生机制,探索PS的合成过程,并期望为该疾病的防治及药物研发提供重要干预靶点。文献表明,PS的合成及分泌受到多种因素的影响与调节,其中,MicroRNAs(miRNAs)的作用越来越受到关注。miRNA-26a(miR-26a)是本课题组在前期研究中选用孕晚期胎鼠肺组织,利用芯片技术筛选出的差异表达miRNA。随后对miR-26a进行系统的生物信息学分析,发现其潜在靶基因SMAD1与肺发育密切相关。SMAD1是骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic protein,BMP)通路下游的一个重要信号分子,文献表明,胚胎肺发育的关键步骤几乎都受到BMP调控。我们课题组前期研究中将miR-26a过表达后,发现SMAD1基因的表达下调,大鼠胎肺aecⅡ合成PS也明显减少。因此,我们推测miR-26a在肺发育、RDS中发挥重要作用。miR-26a在PS合成的功能和机制方面的研究报道甚少。为探索miR-26a合成PS的信号通路,我们首先通过pmirGLO-SMAD1 3’端非翻译区(UTR)双荧光素酶报告基因(DLR)表达系统,验证SMAD1是miR-26a的靶基因;其次,构建过表达及沉默SMAD1的慢病毒载体,感染A549细胞,利用Real-time PCR分析SMAD1、PS mRNA的表达量,结果发现过表达SMAD1后SP-A、SP-B mRNA的表达量显著增加,而沉默SMAD1后SP-A、SP-B mRNA的表达量则显著减少。以上结果提示miR-26a通过靶向SMAD1参与调节PS的合成过程。另外,为了研究miR-26a体内的生物学功能,我们使用聚类规则间隔短回文重复/相关蛋白 9(CRISPR/Cas9)系统成功获得了基因双敲除小鼠(miR-26a-1-/-/miR-36a-2-/-)纯合子后代,然后通过与野生型小鼠对比,利用实时定量PCR检测各组织器官中miR-26a的表达水平,以及肺组织中PS的mRNA水平。此外,利用苏木精-伊红和免疫组织化学染色分析肺组织中的aecⅡ数量和PS的合成情况,结果发现体内miR-26a敲除后,肺组织aecⅱ细胞增多,且合成PS增多。以上结果提示miR-26a在体内aecⅡ合成PS的过程中起着重要作用。第一部分 miRNA-26a靶向SMAD1调节A549细胞合成PS的研究目的:1.验证SMAD1为miRNA-26a的靶基因2.探索miRNA-26a通过SMAD1影响PS合成的信号通路机制方法:1.体外获得hsa-miR-26a与SMAD1 3’UTR结合序列,与pmirGLO载体质粒重组,获得pmirGLO-SMAD1 3’UTR双荧光素酶报告基因(DLR)表达系统,将不同的表达质粒分别与Hsa-miR-26a-5p mimics共转染HEK293T细胞,然后检测各处理组的萤火虫荧光素酶活性值(Firefly luciferase)与海肾荧光素酶活性值(Renilla luciferase),计算并分析相对荧光素酶活性比值(Ff/Rn)。2.将构建的过表达、沉默SMAD1慢病毒及病毒空载体分别感染A549细胞,于72小时后,通过提取总RNA并利用Real-time PCR检测SMAD1、PS的mRNA表达水平。结果:***-SMAD1 wt与Hsa-miR-26a-5p mimics共转染组的相对荧光值较其他两组明显降低,这表明miR-26a与SMAD1 3’UTR区结合,可以有效减少相对荧光值Ff/Rn荧光素酶活性。2.①感染72小时后,高达95%的细胞有绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的阳性表达。②通过real-time PCR 检测 SMAD1、SP-A、SP-B mRNA 的表达情况,结果证明成功获得过表达/沉默SMAD1的A549细胞株;过表达SMAD1组的A549细胞相较于对照组SP-A、SP-B mRNA的表达量均增加;沉默SMAD1组的A549细胞与对照组相比,SP-A、SP-B mRNA的表达量均减少。结论:***1为miR-26a的靶基因。***-26a通过靶基因SMAD1影响PS的合成。第二部分 miRNA-26a敲除小鼠体内PS合成的研究目的:研究miR-26a敲除小鼠肺

关键词： miRNA-26a SMAD1 PS DLR 慢病毒载体 aecⅱ细胞 CRISPR/Cas9 敲基因小鼠

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