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A型塞尼卡病毒与O型、A型、亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

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中国动物传染病学报 2022年第2期30卷 84-92页

作者：施开创谢守玉赵晶莫胜兰刘惠心尹彦文司红彬屈素洁陆文俊冯淑萍粟艳琼广西动物疫病预防控制中心南宁530001 广西大学动物科学技术学院南宁530005

为建立鉴别检测A型塞尼卡病毒(SVA)与O型、A型、亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒(FMDV)的方法,针对SVA 3D基因与O型、A型、亚洲Ⅰ型FMDV VP1基因,分别设计特异性引物和TaqMan探针,经优化反应条件,建立了同时检测SVA与O型、A型、亚洲Ⅰ型FMDV的TaqMa... 详细信息

为建立鉴别检测A型塞尼卡病毒(SVA)与O型、A型、亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒(FMDV)的方法,针对SVA 3D基因与O型、A型、亚洲Ⅰ型FMDV VP1基因,分别设计特异性引物和TaqMan探针,经优化反应条件,建立了同时检测SVA与O型、A型、亚洲Ⅰ型FMDV的TaqMan荧光定量RT-PCR方法。所建立的方法能特异性扩增SVA及O型、A型、亚洲Ⅰ型FMDV,与其他主要猪源病毒无交叉反应;对SVA与O型、A型、亚洲Ⅰ型FMDV质粒标准品的检出下限分别为2.50×10^(1)、2.50×10^(2)、2.50×10^(2)、2.50×10^(2)copies/μL;组内与组间重复性试验的变异系数均小于2%。应用所建立方法检测2019年来自广西的30份临床疑似样品,SVA和O型FMDV的检出阳性率分别为20%和70%,而未能检出A型和亚洲Ⅰ型FMDV。结果表明,本研究所建立的多重荧光定量RT-PCR方法为SVA与O型、A型、亚洲Ⅰ型FMDV的临床检测和流行病学调查提供了特异、敏感、高效的技术手段。

关键词： A型塞尼卡病毒口蹄疫病毒荧光定量RT-PCR 检测方法

A型塞尼卡病毒非编码区假结或吻环结构破坏对病毒拯救的影响

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A型塞尼卡病毒非编码区假结或吻环结构破坏对病毒拯救的影响

作者：王宁青岛农业大学

学位级别：硕士

A型塞尼卡病毒(Senecavirus A,SVA)是一种可引起猪的水疱病的新发病毒。这种病毒被归为小RNA病毒科塞尼卡病毒属。它的基因组是一个正义的,单链的不分节段RNA,长度大约为7300个核苷酸(nt)。小RNA病毒基因组本质上是一种m RNA,尽管它未经... 详细信息

A型塞尼卡病毒(Senecavirus A,SVA)是一种可引起猪的水疱病的新发病毒。这种病毒被归为小RNA病毒科塞尼卡病毒属。它的基因组是一个正义的,单链的不分节段RNA,长度大约为7300个核苷酸(nt)。小RNA病毒基因组本质上是一种m RNA,尽管它未经5’帽结构修饰,但仍然可以通过内部核糖体进入位点(IRES)启动蛋白表达。SVA CH-LX-01-2016(Gen Bank:KX751945.1)是我国具有代表性的分离株。已有研究确定该毒株3’poly(A)尾巴的上游具有一个668 nt 5’非编码区(UTR)和一个68 nt 3’UTR。本课题组基于该毒株建立了一个反向遗传系统,以拯救增强型绿色荧光蛋白(e GFP)标记的SVA,从而促进病毒分子机制的研究。SVA基因组5’UTR包含丙型肝炎病毒(HCV)样的IRES,该结构包括一个位于起始密码子上游的RNA假结,且有研究预测在3’UTR中包含一个吻环结构。假结结构在启动蛋白表达中起重要作用。试验一:本研究中构建了一组SVA(CH-LX-01-2016毒株)的微型基因组,该微型基因组具有所有假结茎II(PKS-II)点突变组合。结果表明,任何点突变组合都不能显著干扰IRES启动蛋白表达。进一步构建了全长SVA c DNA克隆,其中形成PKS-II的c DNA基序被定点突变,完全破坏了IRES中PKS-II的结构。将这种突变的SVA c DNA克隆转染到BSR-T7/5细胞中,结果表明,全突变后的PKS-II不会显著影响反义基因组复制,但是无法从此c DNA克隆中拯救出有活性的SVA。推测突变基序可能破坏了病毒粒子组装的包装信号,从而导致SVA的拯救失败。试验二:推测SVA的假结区域包含两个关键结构即假结茎I和假结茎II(PKS-I和-II)。PKS-I由两部分碱基配对的基序(PKS-Ia和-Ib)组成,它们之间有一个未配对的间距(Up S)。在本研究中,构建了5组PKS-I基序定点突变的SVA微型基因组。双荧光素酶报告基因检测显示,PKS-I基序突变对IRES活性并无显著影响,更不会显著干扰蛋白表达的启动。相应地,构建了5个点突变的SVA c DNA克隆。将这些经基因修饰的c DNA克隆分别转染到BSR-T7/5细胞中,试图拯救具有生物学活性的SVA。结果表明SVA完全能够耐受病毒基因组中的PKS-Ia或Up S区域的突变,相比之下,PKS-Ib的高保真序列可能是病毒拯救所必需的,因为本试验未能从其只有3个点突变的c DNA克隆中成功拯救SVA-IV。试验三:在本实验中,共构建了7个e GFP标记的SVA c DNA克隆,这些克隆在其3’UTR部位均具有不同的突变吻环形成基序(KLFMs)。病毒拯救试验表明,7个e GFP标记的SVA均可从其c DNA克隆中成功拯救,并且所有突变KLFMs经10代病毒传代后均保持遗传稳定性。该试验结果表明,SVA 3’UTR即使含有一个假定的吻环结构,但此结构对病毒复制是不必要的。

关键词：反向遗传学 A型塞尼卡病毒内部核糖体进入位点假结吻环

A型塞尼卡病毒与O型、亚洲I型、A型口蹄疫病毒多重RT-PCR检测方法的建立

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中国预防兽医学报 2020年第9期42卷 905-911页

作者：谢守玉刘惠心施开创赵晶屈素洁尹彦文王树培陆文俊冯淑萍粟艳琼广西动物疫病预防控制中心广西南宁530001 广西大学动物科学技术学院广西南宁530005

为建立鉴别A型塞尼卡病毒(SVA)与O型、亚洲I型、A型口蹄疫病毒(FMDV)的快速检测方法,本研究分别设计4对特异性引物,用于扩增SVA 3D基因(157 bp)、O型FMDV VP1基因(240 bp)、亚洲I型FMDV VP1基因(460 bp)、A型FMDV VP1基因(320 bp)。经... 详细信息

为建立鉴别A型塞尼卡病毒(SVA)与O型、亚洲I型、A型口蹄疫病毒(FMDV)的快速检测方法,本研究分别设计4对特异性引物,用于扩增SVA 3D基因(157 bp)、O型FMDV VP1基因(240 bp)、亚洲I型FMDV VP1基因(460 bp)、A型FMDV VP1基因(320 bp)。经优化引物浓度、退火温度等反应条件,初步建立了同时检测SVA与O型、亚洲I型、A型FMDV的多重RT-PCR方法。利用该方法同时检测SVA及O型、亚洲I型、A型FMDV、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型(PCV2)、PCV3等主要猪源病毒,结果显示该方法仅对SVA及O型、亚洲I型、A型FMDV检测为阳性,其他均为阴性,特异性较强;SVA、O型、亚洲I型、A型FMDV重组质粒标准品10倍倍比稀释后利用本研究建立的多重RT-PCR方法检测,结果显示同一反应体系中,4种重组质粒标准品的检出下限均为2.5×10^2拷贝/μL,敏感性较高;批内、批间重复性试验结果一致,该方法重复性较好。利用本实验建立的方法对2019年采集自广西30份临床疑似样品进行检测,结果显示,SVA、O型FMDV的阳性检出率分别为16.67%和63.33%;未检出亚洲I型及A型FMDV;同时采用国家标准《口蹄疫诊断技术》(GB/T18935-2003)中RT-PCR方法以及文献报道的SVA套式RTPCR方法对FMDV、SVA检测,结果与本实验建立的多重RT-PCR方法检测结果的符合率为100%。本研究首次建立的多重RT-PCR检测方法具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点,为鉴别检测SVA与O型、亚洲I型、A型FMDV提供了有效的技术方法。

关键词： A型塞尼卡病毒口蹄疫病毒多重RT-PCR 检测方法

基于A型塞尼卡病毒结构蛋白VP1间接ELISA检测方法的建立及初步应用

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中国预防兽医学报 2019年第8期41卷 818-823页

作者：赵月龙闫若潜王淑娟马震原班付国赵雪丽谢彩华杨朋霞河南科技大学动物科技学院河南洛阳471003 河南省动物疫病预防控制中心河南郑州450008 河南农业大学牧医工程学院河南郑州450002

为建立A型塞尼卡病毒(SVA)血清学检测方法,本研究根据GenBank中SVA基因序列设计引物,PCR扩增其VP1基因,将目的片段克隆于p ET-32a(+)表达载体中,在大肠杆菌BL21(DE3+)中诱导表达。利用纯化的重组VP1 (rVP1)蛋白作为包被抗原,通过矩阵法... 详细信息

为建立A型塞尼卡病毒(SVA)血清学检测方法,本研究根据GenBank中SVA基因序列设计引物,PCR扩增其VP1基因,将目的片段克隆于p ET-32a(+)表达载体中,在大肠杆菌BL21(DE3+)中诱导表达。利用纯化的重组VP1 (rVP1)蛋白作为包被抗原,通过矩阵法优化ELISA反应条件,初步建立了SVA的间接ELISA抗体检测方法。对该方法的特异性、敏感性和重复性进行检测;利用该方法对43份背景清晰的猪血清进行检测,并与中和试验结果进行比较;同时对205份临床猪血清样品进行检测。结果显示,本研究正确表达了约51.0 ku的可溶性重组蛋白,western blot试验表明纯化的r VP1蛋白具有良好的反应原性,以r VP1蛋白建立了间接ELISA方法。特异性试验结果显示该ELISA方法可以检测SVA抗体,而与FMDV (O/A/Asia I)、 PEDV、 PCV2、PRRSV、PRV等病原的抗血清均无交叉反应;敏感性试验结果显示样品经1∶800倍稀释后折OD450nm值仍大于临界值;批内、批间的重复性试验变异系数均小于10%,具有较好的重复性和稳定性。43份猪血清样品的检测结果与中和试验符合率为93.02%。205份临床猪血清样品的阳性检出率为5.37%。本研究为SVA血清学检测提供了技术手段。

关键词： A型塞尼卡病毒 VP1基因表达间接ELISA

A型塞尼卡病毒与O型、A型、亚洲I型口蹄疫病毒多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

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中国动物传染病学报 2021年

作者：施开创谢守玉赵晶莫胜兰刘惠心尹彦文司红彬屈素洁陆文俊冯淑萍粟艳琼广西动物疫病预防控制中心广西大学动物科学技术学院

为建立鉴别检测A型塞尼卡病毒（SVA）与O型、A型、亚洲I型口蹄疫病毒（FMDV）的方法，针对SVA 3D基因与O型、A型、亚洲I型FMDV VP1基因，分别设计特异性引物和TaqMan探针，经优化反应条件，建立了同时检测SVA与O型、A型、亚洲I型FMDV的T... 详细信息

为建立鉴别检测A型塞尼卡病毒（SVA）与O型、A型、亚洲I型口蹄疫病毒（FMDV）的方法，针对SVA 3D基因与O型、A型、亚洲I型FMDV VP1基因，分别设计特异性引物和TaqMan探针，经优化反应条件，建立了同时检测SVA与O型、A型、亚洲I型FMDV的TaqMan荧光定量RT-PCR方法。所建立的方法能特异性扩增SVA及O型、A型、亚洲I型FMDV，与其他主要猪源病毒无交叉反应；对SVA与O型、A型、亚洲I型FMDV质粒标准品的检出下限分别为2.50×10;、2.50×10;、2.50×10;、2.50×10;拷贝/μL；组内与组间重复性试验的变异系数均小于2%。应用所建立方法检测2019年来自广西的30份临床疑似样品，SVA和O型FMDV的检出阳性率分别为20%和70%，而未能检出A型和亚洲I型FMDV。表明，本研究所建立的多重荧光定量RT-PCR方法为SVA与O型、A型、亚洲I型FMDV的临床检测和流行病学调查提供了特异、敏感、高效的技术手段。

关键词： A型塞尼卡病毒口蹄疫病毒荧光定量RT-PCR 检测方法

A型塞尼卡病毒3′非编码区潜在吻环基序突变对微型基因组蛋白表达的影响

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青岛农业大学学报（自然科学版） 2022年第2期39卷 90-95页

作者：刘拂晓王宁赵地李静孟海蓝李紫薇于永乐董雅琴尼博青岛农业大学动物医学院山东青岛266109 内蒙古农业大学兽医学院内蒙古呼和浩特010018 青岛市黄岛区市场监督管理局山东青岛266500 中国动物卫生与流行病学中心山东青岛266032

A型塞尼卡病毒(Senecavirus A,SVA),可导致猪的口吻部、口腔黏膜、蹄冠部出现水疱样病变,其临床症状与其他水疱型疫病所导致的症状难以区分。该病毒属于小RNA病毒科(Picornaviridae)、塞尼卡病毒属(Senecavirus)成员,其基因组含有5′非... 详细信息

A型塞尼卡病毒(Senecavirus A,SVA),可导致猪的口吻部、口腔黏膜、蹄冠部出现水疱样病变,其临床症状与其他水疱型疫病所导致的症状难以区分。该病毒属于小RNA病毒科(Picornaviridae)、塞尼卡病毒属(Senecavirus)成员,其基因组含有5′非编码区(5′untranslated region,5′UTR)、多聚蛋白的开放阅读框及3′非编码区(3′untranslated region,3′UTR)。过去有报道预测该病毒的3′UTR含有一个三碱基配对的潜在RNA吻环结构,但未被试验证实。构建了7个不同吻环基序突变的SVA微型基因组,将其分别与另一荧光报告质粒共转染细胞后,进行双荧光素酶报告分析。结果证明潜在吻环结构的破坏未能干扰5′UTR启动蛋白的表达。

关键词： A型塞尼卡病毒 3′非编码区吻环微型基因组双荧光素酶报告分析

2018年海南省猪A型塞尼卡病毒血清流行病学调查

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中国动物检疫 2019年第12期36卷 8-11,39页

作者：代蕾王金秀方莉章瑶李亚文谢国信周启转李布勇海南省动物疫病预防控制中心海南海口571100

为了解海南省A型塞尼卡病毒(Senecavirus A,SVA)感染状况,应用间接ELISA方法,对从海南省15个市(县)112个场点采集的2547份猪血清样品进行SVA抗体检测。结果显示:SVA血清样品抗体阳性率为10.9%,场点阳性率为50.0%;15个市(县)的场点阳性率... 详细信息

为了解海南省A型塞尼卡病毒(Senecavirus A,SVA)感染状况,应用间接ELISA方法,对从海南省15个市(县)112个场点采集的2547份猪血清样品进行SVA抗体检测。结果显示:SVA血清样品抗体阳性率为10.9%,场点阳性率为50.0%;15个市(县)的场点阳性率在14.3%~100%之间,其中有6个超过50%;15个市(县)的样品阳性率在1.0%~31.7%之间,大部分市(县)小于10%;规模化养殖场场点阳性率(61.2%)高于散养户(33.3%);仔猪、母猪、后备猪、公猪、育肥猪样品阳性率分别是20.5%、15.5%、13.5%、10.7%、5.9%。结果表明:SVA已扩散至整个海南省,防控形势较严峻,需制定相应防控措施;交通枢纽地区和规模化养殖场的SVA流行面较广,仔猪和种猪群中的SVA流行率较高,应重点加强监测和相关流行病学研究。本研究摸清了海南省猪群中的SVA的感染与分布情况,找出了重点防控区域和防控对象,对于指导该地区SVA防控具有参考意义。

关键词： A型塞尼卡病毒猪血清学调查间接ELISA 抗体检测