A型塞尼卡病毒非编码区假结或吻环结构破坏对病毒拯救的影响

作     者：王宁 

作者单位：青岛农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：单虎;刘拂晓

授予年度：2022年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：反向遗传学 A型塞尼卡病毒 内部核糖体进入位点 假结 吻环 

摘      要：A型塞尼卡病毒(Senecavirus A,SVA)是一种可引起猪的水疱病的新发病毒。这种病毒被归为小RNA病毒科塞尼卡病毒属。它的基因组是一个正义的,单链的不分节段RNA,长度大约为7300个核苷酸(nt)。小RNA病毒基因组本质上是一种m RNA,尽管它未经5’帽结构修饰,但仍然可以通过内部核糖体进入位点(IRES)启动蛋白表达。SVA CH-LX-01-2016(Gen Bank:KX751945.1)是我国具有代表性的分离株。已有研究确定该毒株3’poly(A)尾巴的上游具有一个668 nt 5’非编码区(UTR)和一个68 nt 3’UTR。本课题组基于该毒株建立了一个反向遗传系统,以拯救增强型绿色荧光蛋白(e GFP)标记的SVA,从而促进病毒分子机制的研究。SVA基因组5’UTR包含丙型肝炎病毒(HCV)样的IRES,该结构包括一个位于起始密码子上游的RNA假结,且有研究预测在3’UTR中包含一个吻环结构。假结结构在启动蛋白表达中起重要作用。试验一:本研究中构建了一组SVA(CH-LX-01-2016毒株)的微型基因组,该微型基因组具有所有假结茎II(PKS-II)点突变组合。结果表明,任何点突变组合都不能显著干扰IRES启动蛋白表达。进一步构建了全长SVA c DNA克隆,其中形成PKS-II的c DNA基序被定点突变,完全破坏了IRES中PKS-II的结构。将这种突变的SVA c DNA克隆转染到BSR-T7/5细胞中,结果表明,全突变后的PKS-II不会显著影响反义基因组复制,但是无法从此c DNA克隆中拯救出有活性的SVA。推测突变基序可能破坏了病毒粒子组装的包装信号,从而导致SVA的拯救失败。试验二:推测SVA的假结区域包含两个关键结构即假结茎I和假结茎II(PKS-I和-II)。PKS-I由两部分碱基配对的基序(PKS-Ia和-Ib)组成,它们之间有一个未配对的间距(Up S)。在本研究中,构建了5组PKS-I基序定点突变的SVA微型基因组。双荧光素酶报告基因检测显示,PKS-I基序突变对IRES活性并无显著影响,更不会显著干扰蛋白表达的启动。相应地,构建了5个点突变的SVA c DNA克隆。将这些经基因修饰的c DNA克隆分别转染到BSR-T7/5细胞中,试图拯救具有生物学活性的SVA。结果表明SVA完全能够耐受病毒基因组中的PKS-Ia或Up S区域的突变,相比之下,PKS-Ib的高保真序列可能是病毒拯救所必需的,因为本试验未能从其只有3个点突变的c DNA克隆中成功拯救SVA-IV。试验三:在本实验中,共构建了7个e GFP标记的SVA c DNA克隆,这些克隆在其3’UTR部位均具有不同的突变吻环形成基序(KLFMs)。病毒拯救试验表明,7个e GFP标记的SVA均可从其c DNA克隆中成功拯救,并且所有突变KLFMs经10代病毒传代后均保持遗传稳定性。该试验结果表明,SVA 3’UTR即使含有一个假定的吻环结构,但此结构对病毒复制是不必要的。