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基于Imp肽核酸探针检测血清1型鸭疫里默氏菌及基于gyrA肽核酸诺氟沙星增效作用的研究

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基于Imp肽核酸探针检测血清1型鸭疫里默氏菌及基于gyrA肽核酸诺氟...

作者：邱浩四川农业大学

学位级别：硕士

鸭疫里默氏菌（Riemerella anatipestifer,RA）是一种革兰氏阴性菌,主要引起鸭、鹅、火鸡等禽类的接触性传染病。本文开展了基于膜通透性增强蛋白（Imp）的肽核酸（PNA）探针检测血清1型RA及基于拓扑异构酶A（gyrA）的肽核酸增强诺氟沙... 详细信息

鸭疫里默氏菌（Riemerella anatipestifer,RA）是一种革兰氏阴性菌,主要引起鸭、鹅、火鸡等禽类的接触性传染病。本文开展了基于膜通透性增强蛋白（Imp）的肽核酸（PNA）探针检测血清1型RA及基于拓扑异构酶A（gyrA）的肽核酸增强诺氟沙星抗菌作用的研究,主要内容和结果如下:1.基于Imp肽核酸探针检测血清1型RA的研究和应用利用软件筛选出imp基因的第134-145位点序列合成PNA-imp。在RA imp引物上添加5-FAM荧光标记,然后以血清1型RA CH-1株、血清2型RA CH-2株、ATCC 11845株及未知血清型RA各临床分离株为模板进行PCR扩增,将PNA-imp与扩增产物进行杂交,荧光显微镜下PNA-imp与靶位点特异性结合后会呈现绿色荧光亮斑。结果表明:在PNA-imp 6.2μM、60°C条件下可以特异检测到血清1型RA;对2和6型RA、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌等检测结果均为阴性。2.基于gyrA肽核酸增强抗菌作用的研究和应用利用软件筛选出gyrA基因的第1591-1604位点序列合成PNA-gyrA。对比PNA-gyrA与喹诺酮类药物诺氟沙星对RA CH-1株、RA CH-2株、ATCC 11845株单独作用和共同作用后抑菌效果的差异,结果表明:PNA-gyrA对RA CH-1株、RA CH-2株和ATCC 11845株的最小抑菌浓度（MIC）均大于256μg/mL,无明显抑菌作用;PNA-gyrA与诺氟沙星共同作用后,诺氟沙星对RA CH-1株、RA CH-2株和ATCC 11845株的MIC分别由8μg/mL、32μg/mL和16μg/mL减少到4μg/mL、16μg/mL和8μg/mL,说明PNA-gyrA能够增强诺氟沙星的抗菌作用。综上,以imp为靶基因设计肽核酸探针杂交检测血清1型RA具有良好的特异性。以gyrA为靶基因设计肽核酸对诺氟沙星的抗菌具有增强作用。

关键词：鸭疫里默氏菌膜通透性增强蛋白基因拓扑异构酶A基因肽核酸诺氟沙星

两株鸭疫里默氏菌免疫原和ideR基因差异研究

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两株鸭疫里默氏菌免疫原和ideR基因差异研究

作者：黎雪梅西南大学

学位级别：硕士

研究背景:鸭疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer,RA)属黄杆菌科(Flavobacteriaceae)里默氏杆菌属(Riemerella),为革兰氏阴性短杆菌,有荚膜、无芽孢、无鞭毛,可引起鸭、鹅、火鸡及其它多种鸟类发生感染。主要感染8周龄以内的家鸭,引起... 详细信息

研究背景:鸭疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer,RA)属黄杆菌科(Flavobacteriaceae)里默氏杆菌属(Riemerella),为革兰氏阴性短杆菌,有荚膜、无芽孢、无鞭毛,可引起鸭、鹅、火鸡及其它多种鸟类发生感染。主要感染8周龄以内的家鸭,引起鸭传染性浆膜炎,具有高发病率、高死亡率的特点。产生以心周炎、肝周炎以及气囊炎为主的病理变化。血清型多达21种,相互间缺乏有效的交叉免疫保护。不同血清型或即使同一血清型的不同菌株之间也可能存在较大的毒力变化。一旦鸭群感染此菌,便迅速流行,且很难根除。然而,除已被证实的毒力相关蛋白外膜蛋白A(outer membrane protein A,Omp A)、协同溶血素(cohemolysin protein,CAMP)、载铁体蛋白(siderophone protein,SIP)和Ton B-依赖性受体1(Ton B-dependent receptor 1,Tbd R1)外,关于RA致病的分子机制还知之甚少。本课题组前期从成都某养鸭场分离得到一株RA血清1型SC株,并与在重庆某鸭场分离的RA血清2型AF株进行了比较,研究发现:SC株RA能引起成年产蛋鸭发病甚至死亡而AF株不能,SC株感染鸭的发病率和死亡率均显著高于AF株感染鸭的发病率和死亡率。目前Gen Bank数据库中已经提交了9株RA全基因组序列,其中包括ATCC11845、RA-CH-1、RA-CH-2、DSM 15868、RAGD、RA-SG、CH3、17、153,这些数据对深入研究该致病菌的致病机制与免疫保护性抗原有很大的帮助。研究内容和结果:1、SC ideR与AF ideR基因存在差异根据RA SC和AF全基因组序列,设计一对铁吸收调节子基因(IRONdependent repressor and activator,ide R)引物,采用PCR扩增目的基因,经鉴定正确的产物克隆至p MD18-T载体,序列分析发现,两株菌的ide R基因的开放阅读框均为654 bp,编码217个氨基酸残基。两株菌的ide R基因的编码区存在41处碱基差异,其中6个碱基差异引起了4个氨基酸残基改变,导致蛋白质三级结构的变化。通过Gen Bank分析,AF株ide R序列与其登载的所有RA菌株完全相同,而SC株成为一个独立的分支。2、SC株与AF株RA菌体蛋白ELISA抗体存在差异SC株和AF株RA菌体超声破碎抗原间接ELISA能检测到同源菌株人工感染耐过鸭血清中的抗RA特异抗体。采取同源菌体吸附去除凝集抗体后,ELISA抗体效价下降1个滴度,而异源菌的菌体吸附后则抗体效价未发生变化。结果显示,SC株感染耐过鸭血清中ELISA抗体阳性率低,仅为42.9%,效价也较低,为1:2000000,而AF株感染耐过鸭血清中ELISA抗体阳性率高,达到83.3%且效价很高,一般为1:40006000。3 SC株与AF株RA菌体蛋白差异SC株和AF株菌体超声破碎上清,在SDS-PAGE及western blot分析时,共同显示出2处差异蛋白条带,即SC株约45 KDa及AF株40 KDa特有蛋白条带。质谱分析结果显示,AF差异免疫原性蛋白质为肽基脯氨酸顺反异构酶、假想蛋白、争光霉素C1B水解肽酶、2-型柠檬酸合成酶和4-羟基苯丙酮酸双加氧酶;SC差异免疫原性蛋白质为延伸因子Tu、谷氨酸脱氢酶和假想蛋白RAYM0330。

关键词：鸭疫里默氏菌生物学表型铁吸收调节子 ELISA

不同毒力1型鸭疫里默氏菌外膜蛋白的比较蛋白质组学研究

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不同毒力1型鸭疫里默氏菌外膜蛋白的比较蛋白质组学研究

作者：杨晓辉江西农业大学

学位级别：硕士

鸭疫里默氏菌(Riemere11a anatipestifer,RA)是一种革兰氏阴性、无鞭毛、不运动、不形成芽孢的小杆状菌,主要侵害雏鸭和雏鹅。该菌引起的鸭疫里默氏菌病,又叫鸭疫败血症、鸭传染性浆膜炎等,是一种高致病性、接触性传染病,除直接感染引... 详细信息

鸭疫里默氏菌(Riemere11a anatipestifer,RA)是一种革兰氏阴性、无鞭毛、不运动、不形成芽孢的小杆状菌,主要侵害雏鸭和雏鹅。该菌引起的鸭疫里默氏菌病,又叫鸭疫败血症、鸭传染性浆膜炎等,是一种高致病性、接触性传染病,除直接感染引起急性或慢性败血症、肝周炎、纤维素性心包炎、气囊炎而发生死亡外,还可出现脑膜炎、干酪性输卵管炎、结膜炎、关节炎以及发育迟缓等症状给养殖户带来间接经济损失。目前本菌已有21个血清型,各种血清型之间基本没有交叉保护性。国内外虽然对RA有一些研究,但在毒力因子和致病机理方面的研究尚比较少。为筛选可能的毒力因子,本研究以RA血清1型强毒株RAf64、RAf170和低毒力株RAf104为研究对象,应用超声裂解、超速离心法分别提取了三株RA的外膜蛋白,选定pH3-1111cmIPG干胶条,上样量2mg,等电聚焦共50000Vh;聚焦后经过二次平衡,再用12%的SDS-PAGE凝胶进行第二向分离,最后用胶体考马斯亮蓝G-250进行染色。结果,得到背景色低、重复性好和蛋白点较为分散、清晰的2-DE图谱。用ImageMaster6.0软件对强毒株和低毒力株的外膜蛋白2D凝胶图谱进行比较分析、蛋白点检测和匹配后,挑选强毒株RAf64出现而低毒力株RAf104不出现的13个差异蛋白点进行基质辅助激光解吸电离飞行时间二级质谱鉴定。经过蛋白点的切取、蛋白脱色、胶内酶解、质谱分析和数据库搜索后,结果鉴定成功12个蛋白点,共代表6类蛋白质,分别为：血红素受体(hemin receptor)、外膜蛋白A/motb区域蛋白(Ompa/motb domin protein)、Tonb依赖性受体(tonb-dependent receptor)、假定蛋白(hypothetical protein)、外膜蛋白A (OmpA)和琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase)。其中,血红素受体和OmpA可能是RA重要的毒力因子。综上结果,表明本研究对强毒力RA和低毒力RA菌株外膜蛋白比较研究,成功鉴定12个差异蛋白点、6类蛋白,为RA毒力因子的筛选奠定了基础。

关键词：鸭疫里默氏菌血清1型外膜蛋白比较蛋白质组学

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福建省鸭疫里默氏菌病防制研究

福建省鸭疫里默氏菌病防制研究

作者：程龙飞南京农业大学

学位级别：硕士

鸭疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer, RA)病是由鸭疫里默氏菌引起的雏鸭、雏鹅、雏火鸡以及野鸡等多种雏禽的一种传染性疾病,表现急性或慢性败血症,造成巨大的经济损失。RA感染最早由Riemer于1904年报道在鹅群申发生。此后,美国、... 详细信息

鸭疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer, RA)病是由鸭疫里默氏菌引起的雏鸭、雏鹅、雏火鸡以及野鸡等多种雏禽的一种传染性疾病,表现急性或慢性败血症,造成巨大的经济损失。RA感染最早由Riemer于1904年报道在鹅群申发生。此后,美国、英国、加拿大等国相继报道了该病的发生。我国郭玉璞于1982年首次报道了北京郊区三个商品鸭场发生RA,我省林业杰等于1989年在福州的鸭场分离到RA。至现在全球范围内大多数有集约化养鸭生产的国家和地区均有本病发生,在我国几乎所有养鸭区都有发生。RA为革兰氏阴性小杆菌,属黄杆菌科。至今国际上公认的血清型有1-21共21种。各血清型之间均无显著的交叉保护。药物防治曾是我国许多地区控制该病的主要措施,但受到防治效果差、成本增加、胴体中药物残留等问题的影响,免疫预防是防制该病的发展方向。本研究调查了福建省的主要养鸭密集区流行的鸭疫里默氏菌的血清型,在分离鉴定的163株RA中,血清1型占22.7%,2型占57.1%,13型占1.2%,未定型合计占19%。可见我省流行的鸭疫里默氏菌血清型多而复杂,但以1型和2型为主。筛选佐剂试验结果表明,免疫保护率以油乳剂疫苗最高,其次是蜂胶疫苗,铝胶疫苗最差。副作用从铝胶疫苗、蜂胶疫苗、油乳剂疫苗依次增强;对于同一种疫苗,颈部皮下接种的副作用小于腿部肌肉接种。结合实际生产中的应用效果及副作用观察,最终选用油乳剂疫苗,接种部位选择颈部背侧皮下。我们试制的1型鸭疫里默氏菌油乳剂疫苗经无菌检验和安全性检验均合格,近期保护率高达83.3%-100%,且免疫后56天保护指数仍可达100%。本研究还建立了检测鸭血清中2型RA抗体的ELISA方法,特异性强,与试管凝集试验相比,敏感320倍。用该方法对免疫过2型鸭疫里默氏菌灭活油乳剂疫苗的鸭群进行抗体水平的跟踪测定,发现鸭群在免疫后7天开始产生抗体,免疫后28天左右时达到最高峰,然后开始下降,免疫后56天抗体水平仍高于免疫后14天的水平,该结果与免疫保护试验结果相吻合。在此基础上,我们以我省主要流行的1型和2型RA制备二价灭活疫苗,在我省推广应用100万羽份。

关键词：鸭疫里默氏菌预防控制福建省

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鸭疫里默氏菌对氟喹诺酮药物的主动外排作用

福建农业学报 2014年第5期29卷 413-416页

作者：金龙翔程龙飞陈红梅潘异哲黄瑜福建省农业科学院畜牧兽医研究所福建福州350013 江西农业大学动物科学学院江西南昌330045

为研究鸭疫里默氏菌对诺氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星等氟喹诺酮类药物的主动外排机制,测定25株鸭疫里默氏菌临床分离株对氟喹诺酮类药物的最低抑菌浓度(MIC),同时测定加入主动外排抑制剂碳酰氰间氯苯腙(CCCP)后的... 详细信息

为研究鸭疫里默氏菌对诺氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星等氟喹诺酮类药物的主动外排机制,测定25株鸭疫里默氏菌临床分离株对氟喹诺酮类药物的最低抑菌浓度(MIC),同时测定加入主动外排抑制剂碳酰氰间氯苯腙(CCCP)后的MIC,对二者进行比较分析。结果表明,对5种氟喹诺酮类药物耐药的鸭疫里默氏菌比例分别为84%、72%、76%、68%和36%;76%的菌株同时耐受2种及以上药物。CCCP可以使耐药菌对除左氧氟沙星外药物的敏感性增加,提示主动外排在鸭疫里默氏菌对氟喹诺酮类药物的耐药机制中发挥重要的作用。

关键词：鸭疫里默氏菌氟喹诺酮类药物主动外排最低抑菌浓度

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鸭疫里默氏菌的研究进展

福建畜牧兽医 2009年第5期31卷 19-21页

作者：郑艺杰吴志远王艺娟福建省龙海市畜牧兽医局 363100 福建农林大学动物科学学院福州350002 福建省漳州市芗城畜牧兽医局 363000

由于鸭疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer,RA)分布的广泛性以及引起鸭的高发病率、高死亡率,给养鸭业造成巨大的经济损失。所以,对鸭疫里默氏菌进行研究、分型鉴定,对预防和控制该病有着重要的意义。文章主要从血清分型鉴定方法、诊... 详细信息

由于鸭疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer,RA)分布的广泛性以及引起鸭的高发病率、高死亡率,给养鸭业造成巨大的经济损失。所以,对鸭疫里默氏菌进行研究、分型鉴定,对预防和控制该病有着重要的意义。文章主要从血清分型鉴定方法、诊断方法、防控等方面进行综述。

关键词：鸭疫里默氏菌血清分型诊断防控

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鸭疫里默氏菌的研究进展

畜禽业 2011年第4期22卷 42-43页

作者：王付平山东省蒙阴县畜牧局山东蒙阴276200

鸭传染性浆膜炎是由鸭疫里默氏菌引起的一种重要的鸭细菌病。由于该病分布的广泛性以及引起鸭的高死亡率、发育迟缓和淘汰率增加,给养鸭业造成巨大的经济损失。所以,对鸭疫里默氏菌进行深入研究,以便预防和控制、乃至最终消灭本病,有着... 详细信息

鸭传染性浆膜炎是由鸭疫里默氏菌引起的一种重要的鸭细菌病。由于该病分布的广泛性以及引起鸭的高死亡率、发育迟缓和淘汰率增加,给养鸭业造成巨大的经济损失。所以,对鸭疫里默氏菌进行深入研究,以便预防和控制、乃至最终消灭本病,有着重要的经济意义。文章从血清型、诊断方法、疫苗等方面概述了近年来鸭疫里默氏菌研究进展。

关键词：鸭疫里默氏菌血清型疫苗外膜蛋白

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鸭疫里默氏菌油乳剂疫苗的免疫期和保存期的测定

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福建畜牧兽医 2000年第3期22卷 1-1,3页

作者：李文杨黄瑜程龙飞苏敬良郭玉璞福建农科院畜牧兽医研究所禽病研究室 350013 中国农业大学动物医学院北京100094

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鸭疫里默氏菌噬菌体裂解酶的原核表达

鸭疫里默氏菌噬菌体裂解酶的原核表达