基于Imp肽核酸探针检测血清1型鸭疫里默氏菌及基于gyrA肽核酸诺氟沙星增效作用的研究

作     者：邱浩 

作者单位：四川农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：汪铭书;李春

授予年度：2018年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：鸭疫里默氏菌 膜通透性增强蛋白基因 拓扑异构酶A基因 肽核酸 诺氟沙星 

摘      要：鸭疫里默氏菌（Riemerella anatipestifer,RA）是一种革兰氏阴性菌,主要引起鸭、鹅、火鸡等禽类的接触性传染病。本文开展了基于膜通透性增强蛋白（Imp）的肽核酸（PNA）探针检测血清1型RA及基于拓扑异构酶A（gyrA）的肽核酸增强诺氟沙星抗菌作用的研究,主要内容和结果如下:1.基于Imp肽核酸探针检测血清1型RA的研究和应用利用软件筛选出imp基因的第134-145位点序列合成PNA-imp。在RA imp引物上添加5-FAM荧光标记,然后以血清1型RA CH-1株、血清2型RA CH-2株、ATCC 11845株及未知血清型RA各临床分离株为模板进行PCR扩增,将PNA-imp与扩增产物进行杂交,荧光显微镜下PNA-imp与靶位点特异性结合后会呈现绿色荧光亮斑。结果表明:在PNA-imp 6.2μM、60°C条件下可以特异检测到血清1型RA;对2和6型RA、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌等检测结果均为阴性。2.基于gyrA肽核酸增强抗菌作用的研究和应用利用软件筛选出gyrA基因的第1591-1604位点序列合成PNA-gyrA。对比PNA-gyrA与喹诺酮类药物诺氟沙星对RA CH-1株、RA CH-2株、ATCC 11845株单独作用和共同作用后抑菌效果的差异,结果表明:PNA-gyrA对RA CH-1株、RA CH-2株和ATCC 11845株的最小抑菌浓度（MIC）均大于256μg/mL,无明显抑菌作用;PNA-gyrA与诺氟沙星共同作用后,诺氟沙星对RA CH-1株、RA CH-2株和ATCC 11845株的MIC分别由8μg/mL、32μg/mL和16μg/mL减少到4μg/mL、16μg/mL和8μg/mL,说明PNA-gyrA能够增强诺氟沙星的抗菌作用。综上,以imp为靶基因设计肽核酸探针杂交检测血清1型RA具有良好的特异性。以gyrA为靶基因设计肽核酸对诺氟沙星的抗菌具有增强作用。