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靶向代谢组学在猫眼草黄素调控青蒿素抗性相关氨基酸代谢中的应用

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靶向代谢组学在猫眼草黄素调控青蒿素抗性相关氨基酸代谢中的应用

作者：姚莹扬州大学

学位级别：硕士

目的:本研究旨在建立性能稳定的内源性氨基酸靶向代谢组学平台,兼容血清和多组织样品,研究青蒿素敏感/抗性疟原虫感染小鼠模型中氨基酸代谢规律,筛选与青蒿素抗性疟密切相关差异氨基酸及其代谢通路,探讨两种疟疾模型下代谢受扰动的共性... 详细信息

目的:本研究旨在建立性能稳定的内源性氨基酸靶向代谢组学平台,兼容血清和多组织样品,研究青蒿素敏感/抗性疟原虫感染小鼠模型中氨基酸代谢规律,筛选与青蒿素抗性疟密切相关差异氨基酸及其代谢通路,探讨两种疟疾模型下代谢受扰动的共性和特异性,为研究青蒿素抗性疟原虫入侵宿主体内的代谢机制提供科学依据。青蒿素抗性疟原虫的出现加剧了疟疾清除的压力。在前期非靶向代谢组学分析中发现,猫眼草黄素（Chrysosplenetin,CHR）可协同青蒿素（Artemisinin,ART）,双向调节青蒿素敏感/抗性疟原虫引起宿主的代谢表型差异。本论文通过进一步构建质谱靶向代谢组学平台,对前期筛选的13种目标代谢物进行验证和确认,明确与CHR调节作用相关的氨基酸,并对潜在作用的氨基酸代谢途径进行分析,明确CHR调控青蒿素抗性疟原虫引起宿主特异性扰动的潜在氨基酸及其作用,探究CHR作为ART耐药小分子抑制剂的代谢调节机制。方法:1、内源性氨基酸靶向代谢组学平台的构建基于高效液相色谱串联三重四级杆质谱（HPLC-MS/MS）技术,构建同时测定13种代谢物的靶向代谢组学平台。分别优化每种目标氨基酸的质谱条件,并摸索13种代谢物同时检测的最优液相条件,包括色谱柱、流动相组成,考察是否兼容血清和组织样品。最后对该平台的选择性、标准曲线的线性范围、检出限及定量限、日内及日间精密度、基质效应及回收率和样品稳定性进行评价。2、基于靶向代谢组学的青蒿素敏感/抗性疟原虫感染小鼠氨基酸代谢差异研究构建青蒿素敏感/抗性疟原虫感染小鼠模型,分别收集血清、肝脏、脾脏、肾脏和肠组织样品。基于构建的内源性氨基酸靶向代谢组学平台进行数据采集,并对获取数据进行统计学分析,筛选差异氨基酸,并作相关通路富集分析。基于KEGG数据库,绘制全局代谢通路图,探讨两种疟疾模型的氨基酸代谢扰动。3、猫眼草黄素调控青蒿素敏感/抗性疟原虫感染小鼠氨基酸代谢研究在构建青蒿素敏感/抗性疟原虫感染小鼠模型上,将小鼠随机分为空白对照组、ART单用治疗组和ART-CHR（1:2）复配组,连续灌胃给药7天后分别收集血清、肝脏、脾脏、肾脏和肠组织样品。同样方法进行数据采集,并对获取数据进行深入分析,探究ART与CHR联用前后对青蒿素敏感/抗性疟原虫感染后宿主氨基酸代谢的调控差异。结果:1、论文构建了 13种内源性代谢物同时测定的LC-MS/MS靶向代谢组学平台。该平台的选择性、标准曲线的线性范围、检出限及定量限、日内及日间精密度、基质效应及回收率和样品稳定性均符合方法学要求。2、利用构建的内源性氨基酸靶向代谢组学平台,完成了青蒿素敏感/抗性疟原虫感染小鼠生物样品分析。两种疟疾小鼠表现出不同氨基酸代谢特征。青蒿素敏感疟原虫感染小鼠共扰动了 11种代谢物,改变了血清中甘氨酸（Glycine,Gly）、丝氨酸（Serine,Ser）、赖氨酸（Lysine,Lys）、苯丙氨酸（Phenylalanine,Phe）、谷氨酰胺（Glutamine,Gln）、色氨酸（Tryptophan,Trp）和氧化三甲胺（Trimethy-amine N-Oxide,TMAO）水平,肝脏中 Ser、缬氨酸（Valine,Val）、牛磺酸（Taurine,Tau）、Phe、丙氨酸（Alanine,Ala）、Gln、Trp和TMAO水平,脾脏中Val、Phe、Tau和Trp水平和肾脏中Val、Gln、Tau、Phe、异亮氨酸（Isoleucine,Ile）、Trp 和 TMAO水平,以及肠组织中 Trp、Lys、Tau和TMAO被扰动。青蒿素抗性疟原虫感染小鼠共扰动了 9种氨基酸,扰动了血清中 Ile、、Lys 和 TMAO 水平,肝脏中 Ser、Gln、Gly、Tau 和 TMAO,脾脏中 Val、Ala和Tau,肾脏中Val、Tau和TMAO,以及肠组织中的Tau和TMAO。青蒿素敏感疟原虫和抗性疟原虫感染小鼠的代谢模式也有显著性差异,血清、肝脏中的氨基酸差异更大,而肠组织中未见差异。3、利用构建的内源性氨基酸靶向代谢组学平台,完成了青蒿素敏感/抗性疟小鼠接受ART单用和ART-CHR（1:2）联合给药后的生物样品分析。青蒿素敏感疟小鼠接受ART治疗后,血清中Trp水平下调,肝脏中脯氨酸（Proline,Pro）上调,肾脏中Phe上调,肠组织中Gln和Ile水平改变。接受ART-CHR（1:2）治疗后,血清中Gly上调,Trp下调,Gly、Pro和苏氨酸（Threonine,Thr）较ART给药存在含量差异;肝脏中Phe和Thr较ART给药有差异,而脾脏中Ser、Gly、Val和Trp有差异;肾脏中TMAO、Val、Phe和Ile水平改变,另外Ser、Val和Tau水平较ART高;肠组织中Gly、Tau、Gln和Ile水平改变,但两种给药并无代

关键词：靶向代谢组学猫眼草黄素青蒿素抗性氨基酸氧化三甲胺

伯氏疟原虫青蒿素抗性相关的消减cDNA文库构建

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2004年第3期22卷 139-143页

作者：贝祝春王京燕军事医学科学院微生物与流行病研究所北京100071

目的　构建伯氏疟原虫青蒿素抗性相关的消减cDNA文库。　方法　提取伯氏疟原虫K173株 (NS)与青蒿素抗性株 (AR)的总RNA ,superSMART法合成双链cDNA ,分别以NS为消减方 (driver) ,AR为试验方 (tester)及AR为driver ,AS为tester进行双向... 详细信息

目的　构建伯氏疟原虫青蒿素抗性相关的消减cDNA文库。　方法　提取伯氏疟原虫K173株 (NS)与青蒿素抗性株 (AR)的总RNA ,superSMART法合成双链cDNA ,分别以NS为消减方 (driver) ,AR为试验方 (tester)及AR为driver ,AS为tester进行双向抑制性消减PCR(SSHPCR)。富集的差异表达cDNA克隆到pMD18 T载体构建消减文库。　结果　NS AR和AR NS消减文库分别获得 3 95个和 5 0 6个阳性克隆 ,从NS AR和AR NS文库中随机挑取 10 8个克隆PCR鉴定 ,分别有 10 0个和 10 4个含插入片段 ,大小在 0 .2 5～ 2kb之间。　结论　成功构建了伯氏疟原虫青蒿素抗性相关的消减cDNA文库。

关键词：伯氏疟原虫青蒿素抗性 cDNA文库 PCR 基因文库

云南省恶性疟原虫氯喹及青蒿素抗性相关基因的联合突变分析

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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2017年第3期35卷 202-208页

作者：董莹孙艾明邓艳陈梦妮徐艳春毛祥华云南省寄生虫病防治所云南省疟疾研究中心云南省虫媒传染病防控研究重点实验室普洱665000 大理大学基础学院大理671000

目的分析云南省恶性疟原虫抗氯喹转运蛋白(Plasmodium falciparum chloroquine resistant transporter,Pfcrt)基因和青蒿素抗性相关(K13)基因的联合突变特性。方法收集2012年8月-2015年12月寄生虫病防治信息管理系统登记和报告的云南省... 详细信息

目的分析云南省恶性疟原虫抗氯喹转运蛋白(Plasmodium falciparum chloroquine resistant transporter,Pfcrt)基因和青蒿素抗性相关(K13)基因的联合突变特性。方法收集2012年8月-2015年12月寄生虫病防治信息管理系统登记和报告的云南省恶性疟病例滤纸血样和流行病学史等相关信息,提取疟原虫DNA,巢式PCR扩增恶性疟原虫Pfcrt基因exon2区和K13基因kelch结构域并测序,测序序列与2655199、PF3D7_1343700参比序列进行比对,用MEGA 5.04、Arlequin 3.01软件分析Pfcrt基因exon2区、K13基因kelch结构域的单倍型、单倍型间期望杂合度(He)及其群体间的遗传分化指数(Fst)等,用Network 4.6.0软件制作单倍型中介网络进化图,采用Epi Data 3.1软件建立数据库,SPSS 21.0统计学软件进行数据分析。结果共收集恶性疟病例血样234份,Pfcrt基因exon2区、K13基因kelch结构域巢式PCR扩增产物同时成功测序192份。其中,云南省本地感染病例血样12份,自非洲、缅甸感染的病例血样分别为30和150份。218份血样的Pfcrt基因exon2区DNA序列有7种单倍型,He为0.238 5,错义突变序列占83.0%(181/218),72~76位点呈单重突变(CVMNT)、双重突变(SVMNT)、三重突变(CVIET)的比例分别为1.8%(4/218)、6.4%(14/218)和74.8%(163/218),7种单倍型以氯喹敏感型CVMNK为起始,再按单重、双重及三重突变的路径逐步进化。192份血样的K13基因kelch结构域DNA序列有21种单倍型,He为0.044 9,错义突变序列占35.9%(69/192),在16、446、676等9个位点均只发生单重突变,F446I的突变率最高,为25.0%(48/192),21种单倍型的中介网络图显示"星状"布局。云南省本地恶性疟原虫种群与缅甸种群间的Fst最小,为0.020 3。Pfcrt基因的氯喹敏感型CVMNK血样中,K13基因kelch结构域位点突变的比例为20.6%(7/34),氯喹抗性型CVMNT、CVIET血样中的检出比例分别为1/4和36.4%(51/140)。结论云南省疫情报告病例中恶性疟原虫的氯喹、青蒿素相关抗性基因的联合突变率为27.1%,且青蒿素抗性基因突变型之间可能存在种群扩张模式。

关键词：云南省恶性原疟虫氯喹抗性青蒿素抗性氯喹转运蛋白基因青蒿素抗性相关基因联合突变分析

暗罗素对青蒿素抗性和氯喹抗性鼠疟的抗疟活性以及与传统抗疟药配伍的可行性研究

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暗罗素对青蒿素抗性和氯喹抗性鼠疟的抗疟活性以及与传统抗疟药配...

作者：孙红霞成都中医药大学

学位级别：硕士

目的:1、建立伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟模型,考察其抗性指数;2、在前期实验的基础上继续考察复方蒿甲醚和暗罗素对伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟和氯喹抗性鼠疟的疗效差异;3、探讨暗罗素抗鼠疟特点以及配伍青蒿素类抗疟药治疗鼠疟的疗效差... 详细信息

目的:1、建立伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟模型,考察其抗性指数;2、在前期实验的基础上继续考察复方蒿甲醚和暗罗素对伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟和氯喹抗性鼠疟的疗效差异;3、探讨暗罗素抗鼠疟特点以及配伍青蒿素类抗疟药治疗鼠疟的疗效差异。方法:在前期伯氏疟原虫青蒿素抗性株培育的基础上,继续以四天抑制给药法每代逐步增加给药剂量,并通过尾静脉取血涂片镜检转阴率,测定最新得到的耐药虫株的ED,并计算抗性指数。以伯氏疟原虫常规鼠疟为模型设置复方蒿甲醚、蒿甲醚、青蒿素、本芴醇、暗罗素五种药物的等效剂量组,分别考察复方蒿甲醚和暗罗素在1倍、1.5倍、2倍、2.5倍和3倍等效剂量下对伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟的疗效差异;考察暗罗素配伍复方蒿甲醚与单独使用暗罗素及复方蒿甲醚对伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟的疗效差异;考察复方蒿甲醚、蒿甲醚、本芴醇及其配伍暗罗素后对伯氏疟原虫氯喹抗性鼠疟的疗效差异。抗疟药效实验采用四天抑制给药法,采血镜检给药后24小时原虫血症密度、转阴率及28天治愈率。结果:1、伯氏疟原虫常规株经青蒿素逐量递增给药法连续培养到第53代,其中对50代进行抗性考察,ED为3957.632 mg/kg,抗性指数为15.68,与前期相比有所提升(第42代抗性指数为14.15)。2、1倍、1.5倍、2倍、2.5倍及3倍等效剂量的复方蒿甲醚对伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟均有抑制作用,但均没有达到28天100%治愈率,各组间转阴率变化比较有统计学意义。青蒿素抗性株对复方蒿甲醚有可疑耐药(原虫血症密度>0.005)。复方蒿甲醚对伯氏疟原虫氯喹抗性鼠疟28天治愈率为100%,本芴醇与蒿甲醚对伯氏疟原虫氯喹抗性鼠疟28天治愈率均未达到100%,各组见转阴率变化有统计学意义,氯喹抗性株对蒿甲醚与本芴醇亦产生交叉耐药。3、1倍、1.5倍、2倍、2.5倍及3倍标准计量的暗罗素对伯氏疟原虫青蒿素抗性株均有抑制作用,但均没有达到28天100%治愈率,各组间转阴率变化比较有统计学意义。2倍标准计量的暗罗素对伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟28天治愈率最高,为30%,2.5倍和3倍标准计量的暗罗素对伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟28天死亡率为100%。4、暗罗素配合复方蒿甲醚与单独使用暗罗素及复方蒿甲醚治疗青蒿素抗性鼠疟后,原虫生长抑制有所提升,各组之间转阴率变化有差异(P素治疗伯氏疟原虫氯喹耐药鼠疟后治愈率可达100%,本芴醇、蒿甲醚单药及其配合暗罗素治疗伯氏疟原虫氯喹耐药鼠疟后治愈率均小于100%。复方蒿甲醚配合暗罗素后疗效改善无明显差异(P>0.05),本芴醇、蒿甲醚配合暗罗素后疗效改善有差异(P青蒿素抗性鼠疟模型确认建立,抗性指数为15.68;青蒿素抗性鼠疟对复方蒿甲醚疑似耐药,提高用药剂量后对目前培育的青蒿素抗性鼠疟治疗均不能达到100%治愈率;复方蒿甲醚对伯氏疟原虫氯喹抗性鼠疟有较好疗效,且药后24h转阴率明显优于本芴醇及蒿甲醚;配合暗罗素后可以一定程度增加疗效;暗罗素对伯氏疟原虫青蒿素抗性株及氯喹抗性株均有直接的治疗作用,暗罗素剂量增加,杀虫效果提升,毒性亦提升。

关键词：暗罗素伯氏疟原虫青蒿素抗性氯喹抗性复方蒿甲醚蒿甲醚本芴醇

复方蒿甲醚及其配合中药黄芪对青蒿素抗性和氯喹抗性鼠疟的药效研究

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复方蒿甲醚及其配合中药黄芪对青蒿素抗性和氯喹抗性鼠疟的药效研...

作者：徐志慧成都中医药大学

学位级别：硕士

目的：建立伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟模型,在前期实验的基础上继续考察复方蒿甲醚及其它抗疟药物以及复方蒿甲醚配伍中药黄芪后对伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟和氯喹抗性鼠疟的疗效差异。方法：在前期伯氏疟原虫青蒿素抗性株培育的基础上,... 详细信息

目的：建立伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟模型,在前期实验的基础上继续考察复方蒿甲醚及其它抗疟药物以及复方蒿甲醚配伍中药黄芪后对伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟和氯喹抗性鼠疟的疗效差异。方法：在前期伯氏疟原虫青蒿素抗性株培育的基础上,继续以四天抑制给药法每代逐步增加给药剂量,并通过尾静脉取血涂片镜检转阴率并测定EDso,然后计算最新得到的耐药虫株的抗性指数。以伯氏疟原虫常规鼠疟为模型设置复方蒿甲醚、蒿甲醚、青蒿素、本芴醇、黄芪五种药物的等效剂量组,以动物与人体的每公斤体重剂量折算系数来换算黄芪对小鼠的给药等效剂量,考察复方蒿甲醚在1倍、1.5倍、2倍、2.5倍和3倍等效剂量下对伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟的疗效差异,并考察配伍黄芪后对疗效的影响：考察复方蒿甲醚、蒿甲醚、青蒿素、本芴醇及其配伍黄芪后对伯氏疟原虫氯喹抗性鼠疟的疗效差异。抗疟药效实验采用四天抑制给药法,采血镜检药后24小时原虫血症密度、转阴率及28天治愈率。结果:1、伯氏疟原虫常规株经青蒿素逐量递增给药法连续培养到第27代,其中对24代进行抗性考察,ED50为2098.575 mg/kg,抗性指数为8.31。2、复方蒿甲醚1倍等效剂量组及1.5倍、2倍、2.5倍、3倍等效剂量的复方蒿甲醚对伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟均有抑制作用,但均没有达到28天100%治愈率,各组间转阴率变化比较有统计学意义。青蒿素抗性株对复方蒿甲醚有可疑耐药(原虫血症密度>0.005)。复方蒿甲醚对伯氏疟原虫氯喹抗性鼠疟28天治愈率为100%,本芴醇与蒿甲醚对伯氏疟原虫氯喹抗性鼠疟28天治愈率均未达到100%,各组见转阴率变化有统计学意义,氯喹抗性株对蒿甲醚与本芴醇亦产生可疑耐药。3、黄芪对伯氏疟原虫青蒿素抗性株及氯喹抗性株并无直接治疗作用,但当提高复方蒿甲醚为3倍标准剂量时,配合黄芪可以提高药物的治疗效果(P抗性鼠疟后可逆转小鼠的肝脾损害。4、复方蒿甲醚及配合黄芪治疗伯氏疟原虫氯喹耐药鼠疟后治愈率可达100%,本芴醇、蒿甲醚单药及其配合黄芪治疗伯氏疟原虫氯喹耐药鼠疟后治愈率均小于100%。复方蒿甲醚配合黄芪后疗效改善无明显差异(P>0.05),本芴醇、蒿甲醚配合黄芪后疗效改善有差异(P青蒿素抗性鼠疟模型确认建立,抗性指数为8.31;青蒿素抗性鼠疟对复方蒿甲醚疑似耐药,提高用药剂量后对目前培育的青蒿素抗性鼠疟治疗均不能达到100%治愈率;复方蒿甲醚对伯氏疟原虫氯喹抗性鼠疟有较好疗效,且药后24h转阴率明显优于本芴醇及蒿甲醚;配合黄芪后可以一定程度增加疗效。

关键词：青蒿素抗性氯喹抗性复方蒿甲醚蒿甲醚本芴醇疗效

垂枝暗罗叶醇提物对伯氏疟原虫敏感鼠疟以及青蒿素抗性鼠疟的疗效研究

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垂枝暗罗叶醇提物对伯氏疟原虫敏感鼠疟以及青蒿素抗性鼠疟的疗效...

作者：徐诚成都中医药大学

学位级别：硕士

目的:疟疾是严重危害人类健康的虫媒传染性疾病之一,目前在多个国家和地区,已经陆续有传统抗疟药物敏感性降低的临床报道,鉴于此,我们有必要筛选出新的潜在抗疟药物。垂枝暗罗(Polyalthia longifolia ***)作为传统热带地区植物,已有文... 详细信息

目的:疟疾是严重危害人类健康的虫媒传染性疾病之一,目前在多个国家和地区,已经陆续有传统抗疟药物敏感性降低的临床报道,鉴于此,我们有必要筛选出新的潜在抗疟药物。垂枝暗罗(Polyalthia longifolia ***)作为传统热带地区植物,已有文献证实其叶片提取物具有良好的抗疟特性以及较低的毒副作用,可以作为一个很好的新型抗疟药物来源。本实验在此背景下,首先在已有模型基础上继续培育出具有高度抗性且稳定遗传特性的伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟模型,进一步通过实验考察所配置的垂枝暗罗叶醇提物的急性毒性和药物的合理用药区间。在此基础上,分别采用不同剂量下的垂枝暗罗叶醇提物进行对伯氏疟原虫敏感鼠疟以及青蒿素抗性鼠疟的疗效实验,通过实验结果验证垂枝暗罗叶醇提物的有效抗疟剂量以及在抗性鼠疟中的作用疗效。方法:1.按抗性培育递增给药原则,继续培育伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟至第53代,计算耐药鼠疟的ED并得出抗性指数。2.垂枝暗罗叶经乙醇萃取后,按最大剂量给药法进行急性毒性试验,比较小鼠的体重、死亡情况以及各脏器病理变化,得出合理的给药浓度区间。3.根据实验前期结果和相关文献确定垂枝暗罗叶醇提物与青蒿素的标准剂量后,实验进一步选取伯氏疟原虫敏感鼠疟以及青蒿素抗性鼠疟作为模型,先在给药48小时后以及每周采尾血涂片镜检一次,计算各组小鼠的疟原虫平均感染率、平均抑制率、平均转阴率以及14天治愈率,接着对小鼠的体重、肝脾系数、肝脾病理变化以及肝功能相关生化指标总胆红素(TBil)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)的变化进行分析。比较不同剂量的垂枝暗罗叶醇提物与标准剂量下的青蒿素分别使用后对伯氏疟原虫敏感鼠疟以及青蒿素抗性鼠疟的疗效差异。结果:1.继续培育伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟模型至53代,ED为4165.31mg/kg,抗性指数为16.50,高于前期实验以及相关文献抗性指数。2.垂枝暗罗叶醇提取物最大浓度5000mg/kg灌胃给药后,组间小鼠的一般情况、死亡状况、体重、脾脏与肝脏脏器指数以及各脏器病理学观察与空白组比较均未见明显异常(P青蒿素的14天治愈率最高,为90%。比较疟疾感染指标、脾脏系数和血清肝生化指标也与空白组无明显差异(P青蒿素组,其中2倍标准剂量的垂枝暗罗叶醇提物(1600mg/kg)疗效仍高于其余低剂量组,其14天治愈率仅次于青蒿素,为50%。4.在伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟中,2倍标准剂量下的垂枝暗罗叶醇提物(1600mg/kg)的治疗效果最明显。给予2倍标准剂量垂枝暗罗叶醇提取物的抗性小鼠平均感染率为1.83±1.03%,显著低于其余给药组的小鼠(P青蒿素组。分析肝脾系数以及血清TBIL、ALT、AST均低于其余各组,接近正常值(P青蒿素抗性鼠疟模型,其抗性指数高且培育稳定。2.垂枝暗罗叶醇提取物LD远远大于5000mg/kg,在此用药浓度下安全且无毒性。3.两倍标准剂量的垂枝暗罗叶醇提物(1600mg/kg)在伯氏疟原虫敏感鼠疟以及青蒿素抗性鼠疟中均具有明显的疗效,能不同程度杀灭伯氏疟原虫,尤其在抗性鼠疟中具有良好的抗疟药物开发前景。

关键词：垂枝暗罗天然药物疟疾伯氏疟原虫青蒿素抗性

非洲输入恶性疟原虫青蒿素抗性分子标记k13突变及其种群遗传学研究

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非洲输入恶性疟原虫青蒿素抗性分子标记k13突变及其种群遗传学研究

作者：刘宏南京医科大学

学位级别：硕士

疟疾是全球危害最严重的传染病之一,其病原体是疟原虫。恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)是寄生于人体的五种疟原虫之一,其引发的恶性疟发病较急、症状较为严重,甚至导致死亡。非洲是最严重的疟疾流行区,我国目前无疟疾本地感染病例... 详细信息

疟疾是全球危害最严重的传染病之一,其病原体是疟原虫。恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)是寄生于人体的五种疟原虫之一,其引发的恶性疟发病较急、症状较为严重,甚至导致死亡。非洲是最严重的疟疾流行区,我国目前无疟疾本地感染病例。但近年来随着社会经济的发展,日趋频繁的国际间交流和贸易往来,由非洲输入我国的恶性疟病例居高不下,因此加强对非洲恶性疟原虫药物抗性的监测对我国疟疾防控工作具有重大意义。自2006年开始,WHO推荐全球以青蒿素为基础的联合用药(Artemisinin-based combination therapies,ACTs)作为一线抗疟药物来治疗恶性疟,ACTs的使用显著降低了疟疾发病率和死亡率。但是在2008年东南亚地区出现了青蒿素抗性虫株,目前已发展成东南亚地区严重的公共卫生问题。目前虽然非洲恶性疟原虫对青蒿素耐药的相关证据甚少,且以青蒿素为基础的一线复方药物对治疗非重症恶性疟仍然非常有效,但是非洲疟疾的高发病率和高死亡率,抗药性虫株可能成为疟疾防控工作最大的威胁,因此青蒿素耐药性监测至关重要。2014年,研究发现青蒿素抗性与K13-propeller(k13)基因有关,成为青蒿素抗性的分子标记用来监测青蒿素耐药性。本研究以来自非洲36个国家的1561份输入性恶性疟病例样本为研究对象,对青蒿素抗性分子标记k13基因进行多态性及药物选择压力分析,进一步通过微卫星标记分析选择性清除和种群遗传结构,还对可能出现药物选择压的地区的虫株进行遗传背景研究,为输入性恶性疟的临床合理用药提供科学依据,为监测青蒿素耐药恶性疟原虫的扩散提供参考。本研究内容分为三个部分:第一部分非洲输入恶性疟原虫青蒿素抗性标记分子k13突变分析目的:了解非洲输入恶性疟原虫青蒿素抗性分子标记k13基因的突变情况,并进行药物选择压力分析。方法:收集江苏省2011-2019年输入性恶性疟患者血样,对恶性疟原虫k13基因的Kelch螺旋桨域进行PCR扩增并测序。应用DNAstar软件对所有双向测序序列依据峰图进行编辑和校对,用Bio Edit软件将样本序列与参考序列进行比对,应用Dna SP软件分析k13基因序列多态性及进行中性检验,应用MEGA软件计算非同义碱基替代率(d N)和同义碱基替代率(d S)。利用SPSS22.0软件进行数据的统计分析,计算各位点及不同地区、年份之间的k13突变率。结果:来自36个非洲国家的1561份输入性恶性疟样本的k13基因有89份共54个位点发生了突变,非同义突变有35个,同义突变有19个。在来自非洲中部地区的17份样本中检测出与青蒿素抗性相关的突变位点(M476I、A481V、G533A、G533S、N537I、I543T、M579I、M579V、C580Y、P667S、F673I),15例来自赤道几内亚,1例(C580Y)来自加蓬,1例(M579V)来自喀麦隆。来自非洲中部特别是赤道几内亚的样本k13基因非同义突变率及多态性水平均明显高于其他地区,d N/d S比值为3.187。各年份之间突变率的差异无统计学意义。结论:非洲大部分地区恶性疟原中k13基因呈多位点低频率突变,赤道几内亚恶性疟原虫k13基因的突变频率明显高于其他地区,发现多个可能跟青蒿素抗性相关的突变位点,而且d N/d S比值为3.187,可能受到药物选择压影响。第二部分非洲输入恶性疟原虫k13基因侧翼微卫星多态性分析目的:比较非洲各地区非同义突变株与野生株之间微卫星位点期望杂合度的差异,进一步分析恶性疟原虫k13基因是否受到选择性清除的影响。方法:对k13基因侧翼的10个微卫星位点进行分析,应用Gen Al Ex软件计算各群体的期望杂合度(Expected heterozygosity,He),并检验各群体之间He值的差异有无统计学意义,判定是否存在选择性清除。用Arlequin软件分析计算遗传分化系数Fst值,并应用Structure软件分析恶性疟原虫遗传结构。结果:恶性疟原虫五个微卫星位点平均等位基因个数为16.7,He平均值是0.831。对不同地理区域(非洲中部、非洲南部、非洲西部)以及样本来源比较多的国家(赤道几内亚、安哥拉、尼日利亚)的He比较分析,差异未发现具有统计学意义(P>0.05)。将样本按照是否突变(非同义突变株和野生株)和是否具有青蒿素k13抗性相关突变位点(青蒿素抗性相关突变株和野生株)进行分类,比较两者He,差异也不具有统计学意义(P>0.05)。对非洲中部及赤道几内亚、非洲南部及安哥拉、非洲西部的非同义突变株和野生株进行He分析,差异同样无统计学意义(P>0.05)。遗传结构分析显示非洲西部与非洲南部的遗传分化系数Fst值最大为0.028(P<0.05)。在不同国家之间安哥拉和尼日利亚Fst值最大为0.04

关键词：恶性疟原虫青蒿素抗性 k13基因药物选择压微卫星标记选择性清除抗性分子标记遗传背景

暗罗素与青蒿素类药物联合使用对伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟的疗效及相关免疫学机理研究

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暗罗素与青蒿素类药物联合使用对伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟的疗效...

作者：杨叶鹏成都中医药大学

学位级别：硕士

目的:1、培育具有稳定抗性的伯氏疟原虫青蒿素抗性株,并建立伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟模型,考察其抗性指数;2、在前期实验基础上,缩小暗罗素用药区间,探究暗罗素以何种剂量与复方蒿甲醚联合使用可达到较好的抗疟效果;3、考察暗罗素对小... 详细信息

目的:1、培育具有稳定抗性的伯氏疟原虫青蒿素抗性株,并建立伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟模型,考察其抗性指数;2、在前期实验基础上,缩小暗罗素用药区间,探究暗罗素以何种剂量与复方蒿甲醚联合使用可达到较好的抗疟效果;3、考察暗罗素对小鼠血清Ig G含量和腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响;从而探讨暗罗素抗疟的相关免疫学机理。方法:按逐量递增给药法,本实验继续培育伯氏疟原虫青蒿素抗性株至第62代,考察第60代虫株抗性指数。采血涂片镜检原虫感染率,测定抗性株ED50,计算第60代虫株的抗性指数。抗疟疗效试验采用28天治愈法,建立伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟模型,末次给药24h后及第7天后每周采血镜检一次,计算各组小鼠原虫感染率、转阴率、复燃率及28天治愈率,考察不同剂量暗罗素、复方蒿甲醚、青蒿素以及不同剂量暗罗素与复方蒿甲醚联合使用对伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟的疗效差异。采用ELISA法检测小鼠血清中Ig G的含量,再进行腹腔巨噬细胞吞噬功能试验;考察不同剂量暗罗素对小鼠血清中Ig G含量和腹腔巨噬细胞吞噬百分率的影响。结果:1、从伯氏疟原虫青蒿素抗性株第53代继续培育至第62代,计算得出第60代虫株抗性指数为15.78,与前期实验相比,抗性增长变缓。2、1.75倍、2倍及2.25倍暗罗素单独使用对伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟有抑制作用,其中2.25倍暗罗素剂量组小鼠原虫转阴率达66.67%,但均出现复燃,达不到28天治愈。3、2.5倍复方蒿甲醚和3600.00mg/kg/d的青蒿素对伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟均有抑制作用,但其复燃率高,均无法达到28天治愈,虫株对复方蒿甲醚疑似耐药。4、与单独使用暗罗素、复方蒿甲醚比较,2倍、2.25倍暗罗素与2.5倍复方蒿甲醚联合使用对伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟效果相对较好,部分小鼠可达到28天治愈。5、1.75倍、2倍及2.25倍暗罗素对正常小鼠血清中Ig G的含量和胸腺指数基本无影响,但小鼠的脾脏指数有轻微升高。6、伯氏疟原虫青蒿素抗性株感染的小鼠血清中Ig G的含量和脾脏指数升高,胸腺指数基本正常。1.75倍、2倍及2.25倍暗罗素对感染小鼠的胸腺指数基本无影响,但是对感染小鼠血清中Ig G的含量和脾脏指数有影响,2倍和2.25倍暗罗素剂量组小鼠血清中Ig G升高,2.25倍暗罗素剂量组小鼠的脾脏指数明显降低。7、1.75倍、2倍和2.25倍暗罗素可不同程度提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬百分率,其中2.25倍暗罗素剂量组小鼠吞噬百分率最高。结论:建立了第60代伯氏疟原虫青蒿素抗性鼠疟模型,其抗性指数为15.75。2倍、2.25倍暗罗素与2.5倍复方蒿甲醚联合使用对青蒿素抗性鼠疟效果相对较好,部分小鼠可达到28天治愈。暗罗素可能会改善青蒿素抗性虫株感染小鼠的免疫功能。

关键词：伯氏疟原虫青蒿素抗性暗罗素复方蒿甲醚 IgG 吞噬百分率

伯氏疟原虫青蒿素抗性产生与多药抗性基因pbmdr-1的关系

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中国寄生虫病防治杂志 2002年第5期15卷 267-269页

作者：陈颖丹张家埙林宝英中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所

目的　研究伯氏疟原虫青蒿素抗性产生与伯氏疟原虫多药抗性基因 pbmdr- 1的关系。　方法　采集本实验室培育的抗青蒿素伯氏疟原虫阳性小鼠 (抗性指数分别为 18.9和 2 7.4 5 )血 ,制成滤纸干血滴 ,Chelex- 10 0抽提 DNA,设计引物 ,经 PC... 详细信息

目的　研究伯氏疟原虫青蒿素抗性产生与伯氏疟原虫多药抗性基因 pbmdr- 1的关系。　方法　采集本实验室培育的抗青蒿素伯氏疟原虫阳性小鼠 (抗性指数分别为 18.9和 2 7.4 5 )血 ,制成滤纸干血滴 ,Chelex- 10 0抽提 DNA,设计引物 ,经 PCR扩增 ,连接 ,抽提质粒并用双脱氧链末端终止法测定序列 ,然后同 Gen Bank中 pbmdr- 1序列进行比较。　结果　青蒿素抗性株与敏感株均有扩增 ,且抗性株与敏感株两序列相同 ,与基因库中多药抗性基因 pbmdr- 1序列有 99%的同源性。　结论　伯氏疟原虫抗青蒿素虫株抗性产生与多药抗性基因 pbmdr-

关键词：伯氏疟原虫青蒿素抗性基因克隆序列测定比较 pbmdr-1基因多药抗性