恶性疟原虫青蒿素抗性mRNA、ncRNA差异表达及作用分析

作     者：董建伶 

作者单位：广州中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：郭文峰

授予年度：2023年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：恶性疟疾 青蒿素抗性 K13 生物信息学 GEO数据库 

摘      要：目的:已经明确疟原虫的青蒿素抗性与K13突变相关,但其导致抗性的机制还未有明确定论。从GEO数据库中获取恶性疟原虫抗性虫株与正常虫株的RNA-seq数据,利用生物信息学和统计学方法进行系统的整合和分析,以探究K13突变在抗性机制中可能发挥的生物学功能及作用通路,并尝试通过体外实验进行验证。方法:从GEO数据库中分别下载GSE119231、GSE133236数据集,运用在线网站Network Analyst对数据进行分析并筛选差异表达基因。使用GO功能分析、KEGG、Reactome、Pathview通路富集分析对差异m RNA进行注释并将结果可视化。通过STRING数据库构建差异表达m RNA的蛋白互作网络,Cytoscape软件可视化网络图并筛选hub-genes。构建参考基因集并通过GSEA软件对m RNA表达数据进行基因集富集分析。注释差异表达的nc RNA,并在lnc RNA相关数据库查找相互作用信息。体外实验通过复苏恶性疟原虫3D7(敏感株)及3D7 C580Y敲除(青蒿素抗性株),经早期环状体同步及晚期裂殖体同步,使用早期环状阶段存活实验对虫株进行抗性检测。结果:从正常NF54与抗性PB58组筛选出环期差异m RNA 98个,滋养体期56个,裂殖体期1个。环期和滋养体期差异表达m RNA的GO分析结果均富集于黏附滞留和物质转运等基因功能上。在KEGG、Reactome、Pathview通路富集分析中,疟疾通路在两期均被富集。其余显著富集通路包括环期的脂质代谢通路(脂肪酸代谢、脂肪酸降解、脂肪酰基辅酶A合成等)、过氧化物酶体通路以及滋养体期的非特异性丝氨酸/苏氨酸激酶、RNA降解通路。通过PPI分析,确定了环期与滋养体期差异m RNAs的相互作用网络,并分别筛选出前6个hub-genes。GSEA分析显示,滋养体期错配修复、剪切体、果糖和甘露糖代谢等通路在PB58中富集;半胱氨酸、蛋氨酸代谢在NF54中富集。裂殖体期糖酵解/糖异生、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解、囊泡运输中的SNARE相互作用、脂肪酸代谢、GPI-锚定生物合成、果糖和甘露糖代谢等通路在PB58中富集。筛选出环期差异nc RNA 4个,滋养体期差异nc RNA 2个。差异nc RNA包括三个剪切体sn RNA,一个lnc RNA(telomerase RNA),以及两个未注释的nc RNA(PF3D7＿0731000、PF3D7＿0918500)。体外实验结果显示,3D7与3D7 C580Y敲除株红内期在光学显微镜下形态相似。早期环状阶段存活实验中,3D7与3D7 C580Y敲除虫株存活率均1%。结论:1.正常NF54虫株与抗性PB58虫株差异基因主要分布于环期与滋养体期。K13突变可能通过以Pf EMP1为代表的黏附滞留通路;以长链酰基辅酶A合成酶为代表的脂质代谢通路;以Q8IFL7为代表的物质转运通路;以LRP1和各种剪切体sn RNA为代表的错配修复、剪切体、RNA降解等遗传信息处理通路;糖代谢和氨基酸代谢等五方面参与抗性发生机制。2.除剪切体sn RNA外,telomerase RNA以及未注释的nc RNA PF3D7＿0731000、PF3D7＿0108900被差异富集,值得进一步研究验证。