非洲输入恶性疟原虫青蒿素抗性分子标记k13突变及其种群遗传学研究

作     者：刘宏 

作者单位：南京医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：曹俊

授予年度：2021年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100103[医学-病原生物学] 10[医学] 

主      题：恶性疟原虫 青蒿素抗性 k13基因 药物选择压 微卫星标记 选择性清除 抗性分子标记 遗传背景 

摘      要：疟疾是全球危害最严重的传染病之一,其病原体是疟原虫。恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)是寄生于人体的五种疟原虫之一,其引发的恶性疟发病较急、症状较为严重,甚至导致死亡。非洲是最严重的疟疾流行区,我国目前无疟疾本地感染病例。但近年来随着社会经济的发展,日趋频繁的国际间交流和贸易往来,由非洲输入我国的恶性疟病例居高不下,因此加强对非洲恶性疟原虫药物抗性的监测对我国疟疾防控工作具有重大意义。自2006年开始,WHO推荐全球以青蒿素为基础的联合用药(Artemisinin-based combination therapies,ACTs)作为一线抗疟药物来治疗恶性疟,ACTs的使用显著降低了疟疾发病率和死亡率。但是在2008年东南亚地区出现了青蒿素抗性虫株,目前已发展成东南亚地区严重的公共卫生问题。目前虽然非洲恶性疟原虫对青蒿素耐药的相关证据甚少,且以青蒿素为基础的一线复方药物对治疗非重症恶性疟仍然非常有效,但是非洲疟疾的高发病率和高死亡率,抗药性虫株可能成为疟疾防控工作最大的威胁,因此青蒿素耐药性监测至关重要。2014年,研究发现青蒿素抗性与K13-propeller(k13)基因有关,成为青蒿素抗性的分子标记用来监测青蒿素耐药性。本研究以来自非洲36个国家的1561份输入性恶性疟病例样本为研究对象,对青蒿素抗性分子标记k13基因进行多态性及药物选择压力分析,进一步通过微卫星标记分析选择性清除和种群遗传结构,还对可能出现药物选择压的地区的虫株进行遗传背景研究,为输入性恶性疟的临床合理用药提供科学依据,为监测青蒿素耐药恶性疟原虫的扩散提供参考。本研究内容分为三个部分:第一部分非洲输入恶性疟原虫青蒿素抗性标记分子k13突变分析目的:了解非洲输入恶性疟原虫青蒿素抗性分子标记k13基因的突变情况,并进行药物选择压力分析。方法:收集江苏省2011-2019年输入性恶性疟患者血样,对恶性疟原虫k13基因的Kelch螺旋桨域进行PCR扩增并测序。应用DNAstar软件对所有双向测序序列依据峰图进行编辑和校对,用Bio Edit软件将样本序列与参考序列进行比对,应用Dna SP软件分析k13基因序列多态性及进行中性检验,应用MEGA软件计算非同义碱基替代率(d N)和同义碱基替代率(d S)。利用SPSS22.0软件进行数据的统计分析,计算各位点及不同地区、年份之间的k13突变率。结果:来自36个非洲国家的1561份输入性恶性疟样本的k13基因有89份共54个位点发生了突变,非同义突变有35个,同义突变有19个。在来自非洲中部地区的17份样本中检测出与青蒿素抗性相关的突变位点(M476I、A481V、G533A、G533S、N537I、I543T、M579I、M579V、C580Y、P667S、F673I),15例来自赤道几内亚,1例(C580Y)来自加蓬,1例(M579V)来自喀麦隆。来自非洲中部特别是赤道几内亚的样本k13基因非同义突变率及多态性水平均明显高于其他地区,d N/d S比值为3.187。各年份之间突变率的差异无统计学意义。结论:非洲大部分地区恶性疟原中k13基因呈多位点低频率突变,赤道几内亚恶性疟原虫k13基因的突变频率明显高于其他地区,发现多个可能跟青蒿素抗性相关的突变位点,而且d N/d S比值为3.187,可能受到药物选择压影响。第二部分非洲输入恶性疟原虫k13基因侧翼微卫星多态性分析目的:比较非洲各地区非同义突变株与野生株之间微卫星位点期望杂合度的差异,进一步分析恶性疟原虫k13基因是否受到选择性清除的影响。方法:对k13基因侧翼的10个微卫星位点进行分析,应用Gen Al Ex软件计算各群体的期望杂合度(Expected heterozygosity,He),并检验各群体之间He值的差异有无统计学意义,判定是否存在选择性清除。用Arlequin软件分析计算遗传分化系数Fst值,并应用Structure软件分析恶性疟原虫遗传结构。结果:恶性疟原虫五个微卫星位点平均等位基因个数为16.7,He平均值是0.831。对不同地理区域(非洲中部、非洲南部、非洲西部)以及样本来源比较多的国家(赤道几内亚、安哥拉、尼日利亚)的He比较分析,差异未发现具有统计学意义(P0.05)。将样本按照是否突变(非同义突变株和野生株)和是否具有青蒿素k13抗性相关突变位点(青蒿素抗性相关突变株和野生株)进行分类,比较两者He,差异也不具有统计学意义(P0.05)。对非洲中部及赤道几内亚、非洲南部及安哥拉、非洲西部的非同义突变株和野生株进行He分析,差异同样无统计学意义(P0.05)。遗传结构分析显示非洲西部与非洲南部的遗传分化系数Fst值最大为0.028(P0.05)。在不同国家之间安哥拉和尼日利亚Fst值最大为0.04