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大肠杆菌表达的TaqDNA聚合酶的纯化

遗传 2012年第3期34卷 371-378页

作者：刘天磊薛守斌王芳朱琳颖梁微微曲圣轩蔡文博江苏大学食品与生物工程学院镇江212013 兰州大学第二临床医学院兰州730000

Taq DNA聚合酶是分子生物学研究中最常用的热稳定DNA聚合酶之一,与其他热稳定DNA聚合酶具有相似的特征,其纯化策略不但有潜在的应用前景,也对同类聚合酶的分离具有指导意义。已报道的适宜大量制备Taq酶的方案所需成本较高,而文章介绍了... 详细信息

Taq DNA聚合酶是分子生物学研究中最常用的热稳定DNA聚合酶之一,与其他热稳定DNA聚合酶具有相似的特征,其纯化策略不但有潜在的应用前景,也对同类聚合酶的分离具有指导意义。已报道的适宜大量制备Taq酶的方案所需成本较高,而文章介绍了一种利用国产阳离子交换树脂廉价制备Taq酶的方案。在本方案中,采用热变性、(NH4)SO4沉淀与724离子交换层析分离大肠杆菌表达的Taq酶,约18 g Na型树脂干粉一次可回收比活约8 131.98 U/mg、总酶活2.2×105U、近27.07 mg Taq酶。纯化的产率可达48.92%,纯化倍数约59.35。所制酶SDS-PAGE电泳只检测到94 kDa单一蛋白条带,未检测到DNA核酸酶污染,与商品酶的PCR扩增能力无区别。此纯化方法成本低,适合实验室一般性的制备和生产应用。

关键词： TaqDNA聚合酶 724树脂阳离子交换层析

非分型流感嗜血杆菌Hap_s蛋白的分离纯化

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南方医科大学学报 2007年第12期27卷 1880-1883页

作者：李婉宜邝玉李明远杨远蒋中华姚锋陈长春四川大学华西基础医学与法医学院微生物学教研室四川成都610041

目的优化非分型流感嗜血杆菌Haps蛋白质片段的分离纯化方法。方法采用盐析、透析脱盐、超滤浓缩、弱阳离子交换柱Hitrap CM Sepharose Fast Flow层析纯化Haps蛋白,优化Haps蛋白质片段的洗脱条件,包括pH值和离子强度,测定各洗脱液样品在2... 详细信息

目的优化非分型流感嗜血杆菌Haps蛋白质片段的分离纯化方法。方法采用盐析、透析脱盐、超滤浓缩、弱阳离子交换柱Hitrap CM Sepharose Fast Flow层析纯化Haps蛋白,优化Haps蛋白质片段的洗脱条件,包括pH值和离子强度,测定各洗脱液样品在280nm波长处的光吸收值(D280),用折线图显示,SDS-PAGE电泳检测分布图中处于峰值的样品,观察目的蛋白条带的出现。结果弱阳离子交换柱Hitrap CM Sepharose Fast Flow层析纯化HapS蛋白,缓冲液1洗脱液的D280分布为基线,缓冲液2洗脱液的D280分布折线图中有峰值出现,但峰有拖尾,SDS-PAGE电泳检测该洗脱峰主要为低分子量的蛋白条带;五种不同离子强度的缓冲液3洗脱液在100mmol/LNaCl离子强度时,D280的分布折线图显示有较高洗脱峰出现,SDS-PAGE电泳检测该洗脱峰有较明显的110000D的目的条带,其余离子强度下均未见明显洗脱峰出现。结论Sepharose CM FF层析柱分离纯化HapS蛋白质片段时,不同pH值的缓冲液对目的蛋白的洗脱没有明显影响,而主要影响杂蛋白的洗脱;100mmol/LNaCl离子强度的缓冲液3洗脱液获得较好的洗脱效果。

关键词： Haps蛋白阳离子交换层析蛋白纯化

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重组人Ⅲ型胶原蛋白的分离纯化

食品与发酵工业 2020年第16期46卷 159-163页

作者：梁鑫张仁怀吕自力艾华伟刘冬梁波单旭东陈浩然成都中医药大学医学与生命科学学院附属生殖妇幼医院四川成都610041 四川省人口和计划生育科学研究所四川成都610041 成都远睿生物技术有限公司四川成都610000 河南多美康生物药业有限公司河南郑州450000

利用分泌表达重组人Ⅲ型胶原蛋白的毕赤酵母发酵液,通过层析条件的优化,建立了重组人Ⅲ型胶原蛋白一步层析纯化工艺。发酵液以硫酸铵(30%饱和度)沉淀胶原蛋白,沉淀用超纯水复溶后超滤转换介质至20 mmol/L磷酸缓冲液(phosphate buffer,PB... 详细信息

利用分泌表达重组人Ⅲ型胶原蛋白的毕赤酵母发酵液,通过层析条件的优化,建立了重组人Ⅲ型胶原蛋白一步层析纯化工艺。发酵液以硫酸铵(30%饱和度)沉淀胶原蛋白,沉淀用超纯水复溶后超滤转换介质至20 mmol/L磷酸缓冲液(phosphate buffer,PB)(pH 6.0),然后用SP Sepharose HP阳离子交换柱进行纯化,以20mmol/L PB (pH 6.0)-150 mmol/L NaCl洗涤杂蛋白,以20 mmol/L PB (pH 6.0)-250 mmol/L Na Cl洗脱重组人Ⅲ型胶原蛋白。采用该工艺对60 L发酵液进行重组人Ⅲ型胶原蛋白的纯化,产品纯度97.7%,总回收率68.8%,纯化的重组人Ⅲ型胶原蛋白纯度高,热原含量低,可用于医药领域。该研究建立了一步层析法从毕赤酵母发酵液中高效制备重组人Ⅲ型胶原蛋白的纯化工艺,工艺简便、稳定可靠,离子交换层析放大容易,为重组人Ⅲ型胶原蛋白的工业化生产奠定了基础。

关键词：毕赤酵母重组人Ⅲ型胶原蛋白盐析阳离子交换层析

孔石莼(Ulva pertusa)中一种抗TMV活性蛋白的纯化及其特性(英文)

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植物病理学报 2005年第3期35卷 256-261页

作者：刘振宇谢荔岩吴祖建林奇英谢联辉福建农林大学植物病毒研究所

采用硫酸铵盐析和阳离子交换柱层析(CM—Sepharose Fast Flow)，从孔石莼(Ulva pertusa Kjellm)藻体中分离纯化得到1个蛋白，命名为UPCM40。经SDS—PAGE确定其分子量约为36kD，Native—PAGE可知其为单一组分；该蛋白不含糖；其全波长扫... 详细信息

采用硫酸铵盐析和阳离子交换柱层析(CM—Sepharose Fast Flow)，从孔石莼(Ulva pertusa Kjellm)藻体中分离纯化得到1个蛋白，命名为UPCM40。经SDS—PAGE确定其分子量约为36kD，Native—PAGE可知其为单一组分；该蛋白不含糖；其全波长扫描结果显示，该蛋白在190～220nm和250～300nm处有特征吸收峰，在250～300nm范围中的最大吸收峰在270～275nm处。经测定发现该蛋白具较好的抗烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)的活性，当蛋白质浓度为50μg/mL时，对TMV的抑制效果为：在枯斑寄主心叶烟上的侵染抑制率达85．6％，在苋色藜上为90．2％。测定该蛋白对6种供试真菌的抑制效果发现，对镰刀菌(Fusarium oxysporum ***)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)和香蕉炭疽菌(Gloeosporium musarum)均有一定程度的抑菌作用，但抑制活性很低。

关键词：孔石莼阳离子交换层析蛋白纯化抗病毒 TMV

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长链人胰岛素样生长因子-1的分离纯化

中国生物制品学杂志 2012年第6期25卷 778-781页

作者：张文明洪静林殿海孙天玮梁军黄国团浙江优诺金生物工程有限公司浙江安吉313300

目的建立长链人胰岛素样生长因子-1(Long chain Arg3 human insulin-like growth factor-1,LR3IGF-1)的分离纯化方法。方法将LR3IGF-1毕赤酵母工程菌接种至30 L发酵罐进行高密度发酵,发酵液经离心、超滤浓缩后,采用SP Sepharose FF阳离... 详细信息

目的建立长链人胰岛素样生长因子-1(Long chain Arg3 human insulin-like growth factor-1,LR3IGF-1)的分离纯化方法。方法将LR3IGF-1毕赤酵母工程菌接种至30 L发酵罐进行高密度发酵,发酵液经离心、超滤浓缩后,采用SP Sepharose FF阳离子交换层析、Phenyl Sepharose FF疏水层析、S-100凝胶过滤层析和DEAE Sepharose FF层析对发酵上清液中的表达产物进行分离纯化,测定蛋白浓度,计算蛋白收率,并分析纯化样品的浓度。采用MTT法检测各步纯化样品促NIH-3T3细胞增殖的活性。结果纯化LR3IGF-1的蛋白总收率为28%,RP-HPLC纯度可达95%以上。随着纯化过程中样品纯度的增加,LR3IGF-1的活性也相应增强,各纯化步骤基本不影响LR3IGF-1的生物活性。结论初步建立了LR3IGF-1的分离纯化工艺,其简便有效,为LR3IGF-1的规模化生产奠定了基础。

关键词：长链人胰岛素样生长因子-1 阳离子交换层析疏水层析

重组肠激酶催化亚基在毕氏酵母中的高密度发酵、纯化及活性鉴定

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云南大学学报（自然科学版） 2012年第S2期34卷 426-431页

作者：姬秋彦毕研伟肖红剑闫玲梅高丹丹李智华中国医学科学院/北京协和医学院医学生物研究所云南昆明650118

应用RT-PCR和搭桥PCR技术,扩增肠激酶催化亚基的cDNA,测序正确后克隆至酵母分泌型表达质粒p9K中.将重组质粒p9K/EKLC转化至表达宿主pichia pastoris GS115,筛选得到高效表达重组牛肠激酶催化亚基工程菌.经甲醇诱导,目标蛋白肠激酶催化亚... 详细信息

应用RT-PCR和搭桥PCR技术,扩增肠激酶催化亚基的cDNA,测序正确后克隆至酵母分泌型表达质粒p9K中.将重组质粒p9K/EKLC转化至表达宿主pichia pastoris GS115,筛选得到高效表达重组牛肠激酶催化亚基工程菌.经甲醇诱导,目标蛋白肠激酶催化亚基(EKLC)表达并分泌至酵母培养基中.高密度发酵后,经超滤浓缩,采用SP Sepharose F.F一步纯化得到纯度达98%以上的重组目的蛋白,活性达到2.3 U/uL.上述结果表明,本实验成功获得了肠激酶催化亚基,它是一种能将融合蛋白中目标蛋白与载体蛋白裂解释放的有效工具酶.

关键词：重组肠激酶分泌表达高密度发酵阳离子交换层析融合蛋白切割

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MERS冠状病毒核衣壳蛋白原核表达和纯化

军事医学 2015年第12期39卷 919-922页

作者：付洋波胡勇黄成成白圆圆邱立红曹诚高婷军事医学科学院生物工程研究所北京100850

目的构建带有MERS-Co V N(MERS冠状病毒核衣壳蛋白)基因片段的p ET-22b+原核表达载体,并表达和纯化核衣壳蛋白(NP)。方法通过PCR技术扩增NP蛋白基因片段,插入到原核表达载体p ET-22b+上。使用核酸电泳、测序以及小量诱导表达确认所构建... 详细信息

目的构建带有MERS-Co V N(MERS冠状病毒核衣壳蛋白)基因片段的p ET-22b+原核表达载体,并表达和纯化核衣壳蛋白(NP)。方法通过PCR技术扩增NP蛋白基因片段,插入到原核表达载体p ET-22b+上。使用核酸电泳、测序以及小量诱导表达确认所构建克隆的正确性,然后将重组质粒转化进大肠杆菌BL21a(DE3)中,并在大肠杆菌BL21a(DE3)中大规模诱导表达NP蛋白,使用AKTA纯化系统经强阳离子交换层析纯化出NP蛋白。结果测序和小量诱导结果表明,扩增的NP蛋白片段序列正确,所构建的p ET-22b+-NP克隆可在大肠杆菌BL21a(DE3)的包涵体和细胞质中表达;通过阳离子交换层析和浓缩后,蛋白的纯度和浓度都得到明显提高。结论纯化出高纯度、高浓度的NP蛋白,为NP蛋白功能性研究提供重要基础。

关键词：冠状病毒属 MERS-Co V N 原核表达纯化阳离子交换层析

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两步串联层析法纯化抗TNF-α单克隆抗体

生物技术通报 2015年第12期31卷 75-80页

作者：杨辉杨彬马旭通孙文正林小鹊谭世杰广东东阳光药业有限公司东莞523000

旨在建立从重组CHO细胞发酵培养液中纯化抗TNF-α单克隆抗体的两步串联层析法。将含有抗TNF-α单克隆抗体的料液经两次离心、一步过滤的预处理后,用protein A填料捕获,阳离子填料Sourec30精细纯化。精细纯化过程中利用Do E的方法,采用CC... 详细信息

旨在建立从重组CHO细胞发酵培养液中纯化抗TNF-α单克隆抗体的两步串联层析法。将含有抗TNF-α单克隆抗体的料液经两次离心、一步过滤的预处理后,用protein A填料捕获,阳离子填料Sourec30精细纯化。精细纯化过程中利用Do E的方法,采用CCF(Central composite face)设计,探讨了洗脱p H值及盐浓度对纯化的影响。纯化后的抗TNF-α单克隆抗体经HPLC以及毛细管电泳,检测其浓度、纯度以及多聚体含量。结果显示,亲和层析的最佳洗脱条件为p H4.0。通过DOE优化,为达到质量目标(回收率90%以上,纯度97%以上,多聚体0.3%),筛选出最佳洗脱范围为0.05-0.13 mol/L Na Cl以及p H5.7-6.0,选定p H6.0与0.10mol/L Na Cl作为Source洗脱条件,此时回收率94.3%,纯度97.3%,多聚体0.3%,其质量与参比制剂接近。

关键词：两步抗体纯化平台抗TNF-α单克隆抗体亲和层析阳离子交换层析

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鸡蛋清溶菌酶的提取纯化及抗菌活性的检测

黑龙江畜牧兽医 2017年第3期 135-137,294页

作者：雒志恒杨祎琦王永吉陕西理工大学维生素D生理与应用研究所

为了探索鸡蛋清中溶菌酶的提取、纯化方法及抗菌活性检测方法,试验首先采用724型弱酸性阳离子交换树脂对鸡蛋清溶菌酶进行提取,再通过（NH4）2SO4盐析、透析、调整透析液pH值等步骤对溶菌酶进行纯化,最后经真空冷冻干燥,得到白色溶菌酶... 详细信息

为了探索鸡蛋清中溶菌酶的提取、纯化方法及抗菌活性检测方法,试验首先采用724型弱酸性阳离子交换树脂对鸡蛋清溶菌酶进行提取,再通过（NH4）2SO4盐析、透析、调整透析液pH值等步骤对溶菌酶进行纯化,最后经真空冷冻干燥,得到白色溶菌酶成品;进一步将提纯后的样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行纯度鉴定,并进行了抗菌活性检测。结果表明：经离子交换层析和盐析纯化后,样品电泳条带清晰,抑菌圈清晰可见,通过该提取方法提纯的溶菌酶纯度达到电泳纯,且抑菌作用较好,特别是针对枯草芽孢杆菌具有显著的抑菌作用。

关键词：蛋清溶菌酶盐析 (NH4)2SO4 阳离子交换层析抗菌活性检测