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有机磷农药多残留酶联免疫吸附分析方法的研究

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有机磷农药多残留酶联免疫吸附分析方法的研究

作者：张敏上海交通大学

学位级别：硕士

本研究以建立环境中有机磷农药多残留的酶联免疫吸附分析（ELISA）方法为目标,设计合成了有机磷农药通用半抗原,通过结合载体蛋白质制备了通用人工抗原,免疫动物获得了抗多种有机磷农药的群特异性抗血清。在所获得抗体的基础上,建立了... 详细信息

本研究以建立环境中有机磷农药多残留的酶联免疫吸附分析（ELISA）方法为目标,设计合成了有机磷农药通用半抗原,通过结合载体蛋白质制备了通用人工抗原,免疫动物获得了抗多种有机磷农药的群特异性抗血清。在所获得抗体的基础上,建立了有机磷农药多残留ELISA方法。所建立的方法为有机磷农药的快速多残留检测提供了技术手段,具有一定的使用价值和推广应用前景。主要研究结果如下: 1.通过O,O-二乙基硫代磷酰氯和4-氨基丁酸反应合成了有机磷农药通用半抗原二乙基-N-（3-羧基丙基）硫逐磷酰胺酯（简称DENP）,并进行了结构鉴定。 2.采用碳二亚胺法将DENP与牛血清白蛋白（BSA）和鸡卵清蛋白（OVA）进行偶联,制备了通用人工抗原DENP-BSA和包被原DENP-OVA。经鉴定,结合比分别为12︰1和17:1。 3.将通用人工抗原DENP-BSA免疫两只新西兰大白兔,采血获得了针对有机磷农药的群特异性抗血清,效价分别1:102400和1:25600。 4.考察了9种有机磷农药与抗血清的亲和性,发现与半抗原DENP结构高度相似的甲拌磷、乙拌磷,内吸磷与抗体的亲和性最好;与DENP同样含有直链烃结构,但另一端为二甲氧基（硫代）磷酸酯的氧乐果和乐果与抗体的亲和性次之;与DENP一样含有二乙氧基硫代磷酸酯结构,但另一端连接基团为芳环或杂环的辛硫磷、二嗪农、喹硫磷及毒死蜱和抗体的亲和性较弱。 5.建立了用于检测甲拌磷、内吸磷的间接竞争ELISA方法的标准曲线,检测限分别为0.0037mg/L和0.033mg/L。对水样中添加的甲拌磷和内吸磷进行测定,得回收率范围为108.00%~112.00%。

关键词：有机磷农药多残留通用半抗原通用人工抗原群特异性抗血清酶联免疫吸附分析方法

苹果坏死花叶病毒CP基因原核表达及其抗血清制备

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西南大学学报（自然科学版） 2024年第4期46卷 63-69页

作者：邢飞王红清李世访中国农业科学院植物保护研究所/植物病虫害生物学国家重点实验室北京100193 中国农业大学园艺学院北京100193

苹果坏死花叶病毒(Apple necrotic mosaic virus,ApNMV)是近年新发现的病原物,并且是与我国苹果花叶病症状高度相关的重要病毒,进行ApNMV外壳蛋白(coat protein,CP)基因原核表达、制备多克隆抗血清,以建立快速、灵敏、准确的ApNMV常规... 详细信息

苹果坏死花叶病毒(Apple necrotic mosaic virus,ApNMV)是近年新发现的病原物,并且是与我国苹果花叶病症状高度相关的重要病毒,进行ApNMV外壳蛋白(coat protein,CP)基因原核表达、制备多克隆抗血清,以建立快速、灵敏、准确的ApNMV常规检测方法尤为必要.通过设计特异性引物,以RT-PCR方法成功获得ApNMV CP基因序列,插入到原核表达载体pET-28a(+)中构建重组质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3),利用IPTG进行重组蛋白(含His-tag)诱导表达.SDS-PAGE和Western blot分析结果表明,CP基因在大肠杆菌中获得了高效表达,用Ni Sepharose 6 Fast Flow进行蛋白纯化,回收共得到重组蛋白2.4 mg.在屏障环境下免疫2只SPF级新西兰兔,制备出多克隆抗血清,稀释400倍后仍能与ApNMV阳性苹果叶片样品发生免疫反应.由此证明,本研究建立的ApNMV间接ELISA检测方法具有较好的灵敏性,检测效率高,能够用于田间大量样品ApNMV的诊断.

关键词：苹果坏死花叶病毒外壳蛋白基因原核表达抗血清酶联免疫吸附分析方法

β-Casomorphin-7的酶联免疫吸附分析(ELISA)方法的建立

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食品科学 2002年第2期23卷 94-97页

作者：张源淑钟海涛邹思湘陈伟华南京农业大学农业部重点开放动物生理生化研究室 210095

β-酪啡肽-7(β-Casomorphin-7)是一个有代表性的乳源外啡肽,有调节动物消化道运动和采食、内分泌、免疫等多种生物学功能。本研究以β-Casomorphin-7与人血清白蛋白(HSA)经戊二醛交联的复合物作为包被抗原;一抗为鸡抗β-Casomorphin-7... 详细信息

β-酪啡肽-7(β-Casomorphin-7)是一个有代表性的乳源外啡肽,有调节动物消化道运动和采食、内分泌、免疫等多种生物学功能。本研究以β-Casomorphin-7与人血清白蛋白(HSA)经戊二醛交联的复合物作为包被抗原;一抗为鸡抗β-Casomorphin-7与牛血清白蛋白(BSA)交联复合物的抗血清;酶标二抗为兔抗鸡IgG经戊二醛与辣根过氧化物酶(HRP)交联的复合物。包被抗原和一抗的稀释度经方阵稀释实验确定。本实验所建立的竞争ELISA方法的孔间差异为3.3%,板间差异为8.6%,检测灵敏度20ng/ml,检测范围20～320ng/ml,在实验浓度范围内。β-Casomor-phin-7的抗血清与β-内啡肽、脑啡肽、强啡肽、精氨酸降压素和神经降压素等活性肽未显示免疫交叉反应。表明所建立的方法有较高的特异性,可用于酪啡肽的体内功能研究。

关键词：生理学 β-Casomorphin-7 ELISA 多克隆抗体检测酶联免疫吸附分析方法酪蛋白

氟喹诺酮药物格林沙星抗体制备及其icELISA方法建立

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中国食品学报 2014年第6期14卷 187-193页

作者：吕书为雷红涛唐秋实周丽君王睿娇卢蓝蓝王弘沈玉栋孙远明农业部农产品贮藏质量安全风险评估实验室(广州) 广东省食品质量安全重点实验室广州五山510642 中国人民解放军海军总医院北京100037

目的：制备格林沙星多克隆抗体并建立间接竞争酶联免疫吸附分析方法（icELISA）。方法：采用碳二亚胺法将格林沙星偶联于牛血清白蛋白（BSA）作为免疫原,免疫新西兰大白兔获多克隆抗体;采用活泼脂法分别将格林沙星、克林沙星、加替沙星... 详细信息

目的：制备格林沙星多克隆抗体并建立间接竞争酶联免疫吸附分析方法（icELISA）。方法：采用碳二亚胺法将格林沙星偶联于牛血清白蛋白（BSA）作为免疫原,免疫新西兰大白兔获多克隆抗体;采用活泼脂法分别将格林沙星、克林沙星、加替沙星、培氟沙星和沙拉沙星偶联于卵清白蛋白（OVA）,制备5种包被抗原并做性能比较;建立icELISA方法并对其灵敏度和特异性进行评价。结果：成功制备了免疫原和包被抗原及抗体,抗体效价最高达64 000倍。以克林沙星-OVA作异源包被,建立的icELISA方法灵敏度最高,半抑制药物浓度（IC50）为9.14 ng/mL,检测限（IC10）为0.9 ng/mL,检测范围（IC20~IC80）为2.3~36.4 ng/mL,与其他喹诺酮类药物无明显交叉反应。结论：首次制备出格林沙星抗体并建立间接竞争酶联免疫吸附检测方法,该法灵敏度高、特异性强,为分析生物样品中格林沙星含量的测定提供了1种新的方法。

关键词：格林沙星多克隆抗体酶联免疫吸附分析方法异源包被

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松香人工抗原的合成及多克隆抗体的制备

食品科学技术学报 2018年第6期36卷 51-57页

作者：卞欢仇新媛李鹏鹏陈琳耿志明王道营徐为民江苏省农业科学院农产品加工研究所江苏南京210014 南京工业大学生物与制药工程学院江苏南京211816 江苏省肉类生产与加工质量安全控制协同创新中心江苏南京210095

利用脱氢松香胺(DHAM)为半抗原合成了松香的完全抗原、并通过免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体。首先DHAM与琥珀酸酐(SUC)反应合成琥珀酸单酰脱氢松香胺(DHAM-SUC),然后再与牛血清蛋白(BSA)和钥孔血蓝蛋白(KLH)进行偶联,合成了松香的... 详细信息

利用脱氢松香胺(DHAM)为半抗原合成了松香的完全抗原、并通过免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体。首先DHAM与琥珀酸酐(SUC)反应合成琥珀酸单酰脱氢松香胺(DHAM-SUC),然后再与牛血清蛋白(BSA)和钥孔血蓝蛋白(KLH)进行偶联,合成了松香的完全抗原DHAM-SUCBSA和DHAM-SUC-KLH,偶联比分别为12和35。以DHAM-SUC-KLH为免疫原对新西兰大白兔进行免疫,制备了抗血清,效价达1.28×10~5,脱氢松香酸(DHA)和松香酸(AA)的50%抑制浓度(IC_(50))分别为25. 1μg/L和36. 4μg/L。研究合成的松香人工抗原具有理想的免疫原性,获得的多克隆抗体具有较好的灵敏度,可为建立畜禽肉制品中松香残留的酶联免疫吸附分析(ELISA)方法打下基础。

关键词：松香脱氢松香胺人工抗原多克隆抗体酶联免疫吸附分析方法

氯丙嗪抗体制备与酶联免疫吸附测定方法的建立

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现代食品科技 2019年第8期35卷 325-330页

作者：袁利鹏刘波尹凯丹广东农工商职业技术学院热带农林学院

本研究针对动物性食品中违禁药物氯丙嗪残留问题,建立了针对氯丙嗪的酶联免疫吸附测定方法。首次通过以氯丙嗪为原料,先去甲基化合成N-甲基氯丙嗪,再与丙烯酸叔丁酯反应及水解等步骤成功合成了氯丙嗪半抗原(CPZ-H)。半抗原CPZ-H分别与OV... 详细信息

本研究针对动物性食品中违禁药物氯丙嗪残留问题,建立了针对氯丙嗪的酶联免疫吸附测定方法。首次通过以氯丙嗪为原料,先去甲基化合成N-甲基氯丙嗪,再与丙烯酸叔丁酯反应及水解等步骤成功合成了氯丙嗪半抗原(CPZ-H)。半抗原CPZ-H分别与OVA和BSA通过活泼酯法偶联合成包被原与免疫原,采用免疫原CPZ-H-BSA免疫新西兰大白兔成功制备了特异性的抗氯丙嗪的多克隆抗体。基于该抗体建立了快速测定氯丙嗪的间接竞争酶联免疫吸附测定方法(ic-ELISA)。通过优化ic-ELISA方法的最佳工作条件,确定包被原和抗体稀释倍数均为1:8000时效果最好,此时标准曲线的IC50为1.1 ng/mL,线性范围为:0.13 ng/mL^8.8 ng/mL。制备的抗氯丙嗪的多克隆抗体与其它氯丙嗪类似物无交叉反应,特异性好。本研究为今后高特异性氯丙嗪快速检测试剂盒的制备提供依据。

关键词：氯丙嗪半抗原酶联免疫吸附分析方法

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微囊藻毒素在大型潜流人工湿地中的去除效果

中国给水排水 2018年第13期34卷 86-90页

作者：范亮黄津辉重庆交通大学河海学院重庆400074 南开大学环境科学与工程学院天津300071

在优化酶联免疫吸附分析方法(ELISA)的基础上,测定了人工湿地系统中的微囊藻毒素浓度,考察了大型潜流人工湿地对北方城市河道水体中微囊藻毒素的去除效果。结果表明,优化后的ELISA法能够准确测定水体中低浓度的微囊藻毒素,准确性>76%。... 详细信息

在优化酶联免疫吸附分析方法(ELISA)的基础上,测定了人工湿地系统中的微囊藻毒素浓度,考察了大型潜流人工湿地对北方城市河道水体中微囊藻毒素的去除效果。结果表明,优化后的ELISA法能够准确测定水体中低浓度的微囊藻毒素,准确性>76%。人工湿地进水中的微囊藻毒素浓度呈季节性变化,5月—6月浓度最高,其次是9月—11月、7月—8月,3月—4月浓度最低;人工湿地对微囊藻毒素的去除率在47.03%~87.22%之间,平均为59.25%。不同植物组合(芦苇/千屈菜/鸢尾、香蒲/千屈菜/花叶芦荻/鸢尾、芦苇/千屈菜)湿地单元对水体中微囊藻毒素的去除无显著差异,平均去除率分别为58.9%、57.5%、62.0%,低浓度微囊藻毒素的去除与潜流人工湿地的植被生长状况无显著性关系。

关键词：大型潜流人工湿地微囊藻毒素酶联免疫吸附分析方法

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重组人尿激酶原临床Ⅰ期药代动力学研究

中国临床药理学与治疗学 2012年第6期17卷 672-676页

作者：宋海晶杨伟志张卓梅欧伦陈方王清清董立厚刘秀文解放军第306医院急诊部北京100105 同济大学附属上海市第十人民医院骨科上海200072 武警总医院妇产科北京100039 军事医学科学院放射与辐射医学研究所药理毒理研究室北京100850

目的:研究健康受试者单次静脉注射重组人尿激酶原(rhproUK)后的药代动力性质。方法:采用ELISA分析方法测定血浆总uPA、sc-uPA抗原浓度以及联合免疫生色底物法测定纤溶活性变化。结果:健康受试者单次静脉注射给药剂量分别为20、40和60mg... 详细信息

目的:研究健康受试者单次静脉注射重组人尿激酶原(rhproUK)后的药代动力性质。方法:采用ELISA分析方法测定血浆总uPA、sc-uPA抗原浓度以及联合免疫生色底物法测定纤溶活性变化。结果:健康受试者单次静脉注射给药剂量分别为20、40和60mg,血浆uPA、sc-uPA和纤溶活性的AUC和Cmax呈剂量依赖性增加,剂量比为1∶2∶3,AUCuPA之比为1∶2.1∶3.3;AUCsc-uPA之比1∶1.9∶2.9;不同给药剂量组间的uPA、sc-uPA抗原浓度的CLS、VSS、MRT、末端t1/2和tmax等参数无统计学差异。血浆纤溶活性浓度时间曲线的AUC和Cmax随剂量增加而增加,但表现出一定的非线性变化趋势,Cmax之比为1∶2.3∶3.9,AUC之比为1∶2.9∶4.7,CLS与Vd随剂量增加而逐渐减少。结论:健康受试者个体口服20～60mg剂量rhproUK后,血浆总u-PA、sc-uPA抗原浓度变化表现为线性药代动力学;而血浆纤溶活性浓度表现出非线性药代动力学特点。

关键词：人尿激酶原药代动力学酶联免疫吸附分析方法血药浓度

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食品中桔霉素的酶联免疫分析方法研究进展

山东师范大学学报（自然科学版） 2011年第1期26卷 103-105页

作者：王瑶邴欣周建华山东师范大学生命科学学院济南250014 山东省产品质量监督检验研究院济南250103

综述了桔霉素的理化性质、其在食品中的存在及危害、酶联免疫方法的基本原理及食品中桔霉素的酶联免疫吸附分析方法的研究现状,重点介绍了桔霉素人工抗原的合成方法,抗桔霉素抗体的制备原理,以及桔霉素的酶联免疫吸附分析方法的建立.

关键词：桔霉素食品酶联免疫吸附分析方法人工抗原抗体