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鸡滑液支原体磷酸甘油酸激酶的克隆表达及酶学活性测定

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中国动物传染病学报 2021年第3期29卷 71-79页

作者：尚原冰祁晶晶王宇李浩然刘晓涵王少辉李涛田明星于圣青周铁忠锦州医科大学畜牧兽医学院锦州121000 中国农业科学院上海兽医研究所上海200241 扬州大学兽医学院扬州225009

磷酸甘油酸激酶(PGK)是生物进行糖酵解的关键酶,目前未见关于鸡滑液支原体(MS)PGK的相关研究报道。本实验采用Overlap PCR方法对MS的pgk基因进行点突变扩增,然后连接至pET-28a(+)表达载体并在大肠杆菌BL21中表达,纯化获得重组MSPGK(rMSP... 详细信息

磷酸甘油酸激酶(PGK)是生物进行糖酵解的关键酶,目前未见关于鸡滑液支原体(MS)PGK的相关研究报道。本实验采用Overlap PCR方法对MS的pgk基因进行点突变扩增,然后连接至pET-28a(+)表达载体并在大肠杆菌BL21中表达,纯化获得重组MSPGK(rMSPGK)蛋白,然后对纯化后的rMSPGK蛋白的酶学活性进行测定,包括温度、pH及不同底物对酶活的影响,并计算其酶比活力、米氏常数及最大反应速率。结果显示:最终获得了纯化的rMSPGK蛋白,其相对分子质量约为45 kDa;酶学活性测定显示,rMSPGK蛋白的酶比活力为100.70 IU/mg,最适酶促温度为37℃,最适pH为7.5;双倒数法求得rMSPGK蛋白相对于3-PGA的最大反应速率Vmax为370.37μmol/(L?min),米氏常数Km值为3.88 mmol/L;相对于ATP的最大反应速率Vmax为357.14μmol/(L?min),Km值为0.25 mmol/L。综上,本实验成功地表达了MS的PGK蛋白,并获得了酶活力较高的rMSPGK蛋白,为进一步研究鸡滑液支原体代谢和致病机制奠定了基础。

关键词：鸡滑液支原体磷酸甘油酸激酶原核表达酶学活性

滑液囊支原体NADH氧化酶酶学活性及粘附特性研究

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滑液囊支原体NADH氧化酶酶学活性及粘附特性研究

作者：李浩然安徽农业大学

学位级别：硕士

滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)主要引起鸡和火鸡的亚临床呼吸系统疾病、蛋壳顶端畸形及关节渗出型滑膜炎。研究表明,参与支原体代谢相关的酶类,不仅在胞浆中发挥酶的功能,而且在细胞膜上协助支原体粘附和入侵宿主细胞方面发挥... 详细信息

滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)主要引起鸡和火鸡的亚临床呼吸系统疾病、蛋壳顶端畸形及关节渗出型滑膜炎。研究表明,参与支原体代谢相关的酶类,不仅在胞浆中发挥酶的功能,而且在细胞膜上协助支原体粘附和入侵宿主细胞方面发挥作用。NADH氧化酶(NADH oxidase,NOX)是一种氧化还原酶,本论文对滑液囊支原体的NOX酶学活性及粘附特性进行研究,为进一步探索NOX在MS致病过程中的作用提供了分子基础。首先,构建NOX表达菌株BL21(pET28a-MSnox),IPTG诱导表达后,SDS-PAGE电泳分析重组MSNOX(rMSNOX)蛋白表达于上清中。Beaver Beads TM His Tag磁珠对上清中rMSNOX蛋白纯化后,获得纯化的rMSNOX蛋白。Western blot鉴定rMSNOX蛋白具有反应原性,ELISA检测抗rMSNOX兔多克隆抗体效价达到1:102 400及抗rMSNOX兔多克隆抗体介导的补体杀菌实验显示杀菌率为86.42%。NOX在O存在下能催化NADH氧化为NAD,OD测定NADH转化量以此衡量NADH氧化酶酶学活性。酶活测定显示rMSNOX蛋白的酶比活力为14.17 IU/mg,最适酶促温度为37℃,最适p H为7.5,双倒数法求得rMSNOX的最大反应速率V为21.8μmol/(L·min),米氏常数K(NADH)为244.0μmol/L。其次,通过Western blot及悬浮免疫荧光鉴定rMSNOX蛋白亚细胞定位,结果表明rMSNOX蛋白主要存在于MS胞浆中,MS膜表面也有少量的分布。间接免疫荧光检测rMSNOX蛋白对DF1细胞的粘附作用,同时支原体菌落计数法测定抗rMSNOX兔多克隆抗体对MS粘附DF1细胞的抑制效率。结果显示,rMSNOX蛋白能特异性粘附DF1细胞,同时抗rMSNOX兔多克隆抗体能显著抑制MS对DF1细胞的粘附作用,抑制率达到67.87%,为进一步分析MSNOX蛋白在MS粘附宿主细胞中的作用机制,采用Western blot和ELISA法检测rMSNOX与宿主细胞的胞外基质蛋白cPlg和Fn的结合作用,结果显示rMSNOX与cPlg和Fn均具有结合活性。综上所述,本论文对MS的NOX蛋白进行体外重组表达,证实其不仅具有NADH氧化酶的活性,在MS的细胞膜上也有少量分布,并且发挥着粘附宿主细胞的生物学功能。该研究为进一步探索NOX在MS致病过程中的作用提供了分子基础。

关键词：滑液囊支原体 NADH氧化酶酶学活性粘附特性

饲用微生物酶学活性的测定及其发酵红枣饲料营养品质的研究

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饲用微生物酶学活性的测定及其发酵红枣饲料营养品质的研究

作者：邢晓南西北农林科技大学

学位级别：硕士

本试验将从玉米秸秆中分离得到的枯草芽孢杆菌、植物乳酸杆菌及酿酒酵母菌构建为复合微生物菌剂,通过测定各菌株酶学活性及生长特点,确定最适发酵条件,用于发酵红枣饲料,以提高其营养价值,降低毒素等有害物质含量,改善其饲用品质。试验... 详细信息

本试验将从玉米秸秆中分离得到的枯草芽孢杆菌、植物乳酸杆菌及酿酒酵母菌构建为复合微生物菌剂,通过测定各菌株酶学活性及生长特点,确定最适发酵条件,用于发酵红枣饲料,以提高其营养价值,降低毒素等有害物质含量,改善其饲用品质。试验一发酵红枣饲料复合菌剂酶学活性的测定及最适生长条件的探究本试验通过定性和定量的方法,采用纤维素-刚果红筛选培养基,结合纤维素酶活力及产酸抑菌活性的测定,探究不同温度和p H条件下对枯草芽孢杆菌分泌纤维素酶及木质素酶活力和植物乳酸杆菌产酸抑菌能力的影响,以及各菌株生长曲线的测定,充分掌握各菌株的最适泌酶及产酸条件,并确定最佳生长接种时间。结果表明:稀释涂板后,各菌株种子液活菌数均大于9*10cfu·m;枯草芽孢杆菌、植物乳酸菌及酿酒酵母菌菌株的最适生长及接种时间为培养第20 h;综合研究结果表明枯草芽孢杆菌最适产纤维素酶与木质素酶温度和p H分别为37℃和6.5;乳酸菌最适产酸温度为37℃。试验二复合菌剂固态发酵对红枣饲料营养品质的影响试验以枣粉发酵产品营养成分含量,感官状态,p H,黄曲霉毒素B1,玉米赤霉烯酮为评价指标,设计三个递进式关联式试验。试验一,利用酿酒酵母菌(S2,S11)、植物乳酸杆菌(R7,R9)、枯草芽孢杆菌(B26,B37,C61)组合成复合菌剂为试验优化因素,单菌添加梯度为2%,3%,4%,设计三因素三水平正交试验,探究复合菌剂最佳组方;试验二,以不同菌剂添加量(根据试验一探究结果)、水分含量(20%,30%,40%)、麸皮添加量(20%,30%,40%)为试验优化因素设计三因素三水平的正交试验,探究最佳发酵条件;试验三,以发酵时间为唯一变量为试验因素探究最佳发酵时间。结果表明:1)不同菌剂添加比例对红枣饲料营养物质含量具有不同程度影响,黄酮、多酚、还原糖含量及NDF、ADF降解率Mix4、Mix5、Mix8极显著高于其他组合及对照组(P酶烯酮含量均符合我国饲料卫生生产标准。就本试验条件下,枣粉饲料最优发酵条件为:复合菌剂最佳组方为酿酒酵母:植物乳酸杆菌:枯草芽孢杆菌=2:1:2,复合菌剂添加量为3%,麸皮添加量为20%,接种菌剂前发酵基质含水量为20%,发酵时间为6 d。在该条件下,黄酮含量较原料组提高31.23%,多酚含量较原料组提高17.12%。

关键词：饲用微生物红枣生长条件酶学活性黄酮多酚

硫化叶菌病毒dUTPase基因的表达及酶学活性分析

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应用与环境生物学报 2014年第4期20卷 712-716页

作者：朱国东魏云林张琦季秀玲林连兵昆明理工大学生命科学与技术学院昆明650500 云南民族大学图书馆昆明650031

对硫化叶菌病毒(Sulfolobus virus)STSV2脱氧尿苷焦磷酸酶(dUTPase)基因进行克隆表达,并分析其酶学特征.根据STSV2的dUTPase基因序列设计特异性引物,以病毒STSV2 DNA为模板进行PCR扩增,将产物克隆至原核表达载体pET32a(+)中,然后,将其... 详细信息

对硫化叶菌病毒(Sulfolobus virus)STSV2脱氧尿苷焦磷酸酶(dUTPase)基因进行克隆表达,并分析其酶学特征.根据STSV2的dUTPase基因序列设计特异性引物,以病毒STSV2 DNA为模板进行PCR扩增,将产物克隆至原核表达载体pET32a(+)中,然后,将其转化至Escherichia coli BL21(DE3)进行dUTPase的IPTG诱导表达及纯化,通过SDS-PAGE检测其大小,并测定其酶学活性.结果表明,诱导表达的重组dUTPase蛋白分子量(Mr)约为38×103(含pET32a(+)自带的助溶标签),重组dUTPase在Mg2+存在的情况下能特异性催化dUTP生成dUMP和PPi,其反应最适温度为60℃,在pH值3-8之间有较高的活性,其在提高PCR扩增效率和特异性方面具有一定的作用.本研究通过克隆表达获得了硫化叶菌病毒(Sulfolobus virus)STSV2脱氧尿苷焦磷酸酶,其在基因扩增领域有一定的应用价值.

关键词：硫化叶菌病毒脱氧尿苷焦磷酸酶 PCR扩增效率原核表达酶学活性

急性病毒性坏死病毒引物酶表达及酶学活性分析

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水产学报 2013年第9期37卷 1401-1408页

作者：钱璟王崇明潘鲁青黄倢中国海洋大学水产学院海水养殖教育部重点实验室中国水产科学研究院黄海水产研究所

根据急性病毒性坏死病毒(acute viral necrosis virus,AVNV)ORF 024序列设计引物,以AVNV的DNA为模板进行扩增AVNV引物酶(primase)基因,同时构建表达质粒pET32a-prim,并转化至E.coli BL21(DE3)进行诱导表达。SDS-PAGE检测显示诱导表达两条蛋白条带,其中分子量为60 ku的蛋白条带与预期表达蛋白条带大小一致,另一蛋白条带分子量约为55 ku,经Western-blotting及质谱分析鉴定分子量60 ku的蛋白条带为AVNV-引物酶,而表达出的55 ku蛋白条带存在部分引物酶多肽片段。RNA结合荧光染料Pico-Green在30 min内荧光强度比较稳定,从而确定30 min为进行AVNV引物酶活性分析的最佳终止反应时间,并在引物合成实验中观察到30 min内引物酶活性较高。当使用多聚胞嘧啶寡核苷酸poly(d C)为模板时,重组引物酶能特异性催化底物GTP。0.1 mmol/L Zn2+可显著增强引物酶活性,而1mmol/L Mn2+和EDTA能抑制引物酶活性。

关键词：引物酶原核表达 Pico-Green核酸染料酶学活性多聚胞嘧啶寡核苷酸

急性病毒性坏死病毒dUTPase基因的克隆、表达及其产物的酶学活性分析

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水产学报 2011年第9期35卷 1320-1326页

作者：贾志磊王崇明任伟成梁彦韬曲朋李赟中国海洋大学教育部海水养殖重点实验室中国水产科学研究院黄海水产研究所哥德堡大学

根据已测定完成的栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒(acute viral necrosis virus,AVNV)基因组序列,设计特异性引物,以提取的发病扇贝组织总DNA为模板,PCR扩增得到编码AVNV dUTPase的开放阅读框ORF074,将产物克隆至原核表达载体pET32a(+)中,... 详细信息

根据已测定完成的栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒(acute viral necrosis virus,AVNV)基因组序列,设计特异性引物,以提取的发病扇贝组织总DNA为模板,PCR扩增得到编码AVNV dUTPase的开放阅读框ORF074,将产物克隆至原核表达载体pET32a(+)中,构建表达质粒pET32a-dut。然后,将其转化至E.coli BL21(DE3)进行诱导表达。SDS-PAGE检测显示,诱导表达蛋白分子量约为46 ku,与预期表达蛋白大小一致。经Western-blotting及质谱分析鉴定,所表达蛋白即为重组dUTPase。表达产物经Co2+柱纯化后进行酶学活性测定。结果显示,重组dUTPase能特异性催化dUTP,EDTA可以抑制dUTPase的活性,而Mg2+可以增强其活性。

关键词：栉孔扇贝 dUTP焦磷酸酶急性病毒性坏死病毒原核表达酶学活性

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超声波对液体α-淀粉酶酶学活性的影响

天津工业大学学报 2012年第2期31卷 43-46页

作者：石文奇易长海甘厚磊田磊李月武汉纺织大学材料科学与工程学院湖北武汉430073 广东省均安牛仔服装研究院广东顺德528329

采用碘-淀粉比色法研究超声波对液体α-淀粉酶相对活性的影响,探讨超声波功率、超声时间、酶液的pH值、超声后静置时间、温度等参数与液体α-淀粉酶相对活性之间的关系,得出了液体α-淀粉酶酶学活性较佳的处理工艺条件,并将其应用于纯... 详细信息

采用碘-淀粉比色法研究超声波对液体α-淀粉酶相对活性的影响,探讨超声波功率、超声时间、酶液的pH值、超声后静置时间、温度等参数与液体α-淀粉酶相对活性之间的关系,得出了液体α-淀粉酶酶学活性较佳的处理工艺条件,并将其应用于纯棉靛蓝牛仔布的退浆处理.结果表明:适当的超声波处理能提高液体α-淀粉酶酶学活性,超声波联合淀粉酶处理比仅用淀粉酶对牛仔布退浆处理的退浆率提高了约10.2%.

关键词： α-淀粉酶超声波酶学活性牛仔布退浆

褐飞虱细胞色素P450基因CYP6CW1异源表达及其酶学活性初步研究

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褐飞虱细胞色素P450基因CYP6CW1异源表达及其酶学活性初步研究

作者：周露湖北大学

学位级别：硕士

水稻是最重要的粮食作物之一,世界上约有一半以上的人口以稻米为主食。褐飞虱(Nilaparvata lugens Stal. Homoptera:Delphacidae, brown planthopper)是水稻的主要害虫之一。长期以来,人们以化学防治与抗性水稻品种的推广应用相结合的... 详细信息

水稻是最重要的粮食作物之一,世界上约有一半以上的人口以稻米为主食。褐飞虱(Nilaparvata lugens Stal. Homoptera:Delphacidae, brown planthopper)是水稻的主要害虫之一。长期以来,人们以化学防治与抗性水稻品种的推广应用相结合的方法来防治褐飞虱,并取得了一定防治效果。生活中常用的化学杀虫剂可在短期内有效的防治害虫,但易引起环境污染;至于抗性水稻,褐飞虱会产生耐受性而再次猖獗,所以研究褐飞虱与水稻互作的分子机理,可以为寻找有效环保的褐飞虱防治方法提供线索和理论参考。昆虫CYP6家族的细胞色素P450,常被报道在代谢次生物质和适应宿主植物过程中起着重要作用。为了更进一步了解褐飞虱的P450家族的CYP6家族基因的功能,本研究开展了以下工作： 1、本研究根据已登录到GenBank数据库中的序列,克隆了褐飞虱细胞色素P450基因CYP6CW1和家蝇NADPH细胞色素P450还原酶(NADPH-Cytochrome P450reductase, NCPR)基因的开放阅读框(ORF),将测序结果正确的基因片段分别连接到供体质粒MH中,将重组供体质粒MH-CYP6CW1和MH-NCPR分别转化到大肠杆菌DH10p中并作为供体菌;通过MAGIC技术(Mating-assisted genetically integrated cloning)分别将两个目的基因同源重组到受体菌株细胞(Ac-phes菌株)中的杆状病毒穿梭载体上,并筛选出阳性重组子;通过脂质体转介导法转染草地贪夜蛾Sf9(Spodoptera frugiperda)细胞分别获得两种阳性重组子P1代重组杆状病毒上清,反复感染新鲜细胞后得到一定滴度的重组杆状病毒并利用Western Blot杂交检测重组CYP6CW1和NCPR蛋白表达情况。 2、将构建好的CYP6CW1、NCPR重组杆状病毒粒子和氯高铁血红素(3mg/mL)共同感染Sf9昆虫细胞实现两个重组基因的共表达,并获得CYP6CW1重组酶。将重组酶的细胞破碎液与药物苯巴比妥孵育后,利用高效液相色谱法(High performance liquid charomatography, HPLC)图谱分析重组酶CYP6CW1的酶学活性,结果显示与正常细胞相比,共表达的CYP6CW1重组酶可以代谢分解苯巴比妥从而证明CYP6CW1重组酶有一定的代谢活性。本研究利用目前运用广泛的Bac-to-Bac杆状病毒表达系统和交配辅助遗传整合克隆(MAGIC),将褐飞虱CYP6CW1和家蝇NADPH细胞色素P450还原酶基因成功表达于昆虫Sf9细胞中,并获得具有代谢活性的CYP6CW1重组酶。为揭示褐飞虱与水稻互作的分子机制和寻找新的防治策略奠定了一定的理论基础。

关键词：褐飞虱 CYP6CW1 苯巴比妥异源表达酶学活性

猪囊尾蚴dUTPase基因的克隆、表达及其产物的酶学活性分析

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中国农业科学 2010年第1期43卷 192-199页

作者：刘振勇吕志慧郑亚东窦永喜乔军骆学农张艳景志忠才学鹏中国农业科学院兰州兽医研究所/家畜疫病病原生物学国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点实验室/甘肃省动物寄生虫病重点实验室

【目的】克隆、表达猪囊尾蚴dUTPase基因并分析其酶学活性。【方法】通过RT-PCR的方法克隆猪囊尾蚴dUTPase基因,将其与pET载体连接并在原核系统中高效表达;表达产物经Ni柱纯化后进行酶学活性测定。【结果】序列分析表明猪囊尾蚴dUTPase... 详细信息

【目的】克隆、表达猪囊尾蚴dUTPase基因并分析其酶学活性。【方法】通过RT-PCR的方法克隆猪囊尾蚴dUTPase基因,将其与pET载体连接并在原核系统中高效表达;表达产物经Ni柱纯化后进行酶学活性测定。【结果】序列分析表明猪囊尾蚴dUTPase基因与六钩蚴的dUTPase基因核苷酸同源性为100%,而且其氨基酸序列中同样存在5个保守基序。SDS-PAGE显示在21kD附近出现与目的蛋白大小相符的特异条带,表达产物经纯化后dUTPase的含量为2.863mg·mL-1。酶学活性试验证实重组dUTPase能特异性降解dUTP,同时EDTA可以抑制dUTPase的活性;而Mg2+可以增强猪囊尾蚴dUTPase的活性。【结论】成功克隆表达了猪囊尾蚴dUTPase基因并鉴定了它的酶学活性,为进一步研究dUTPase在猪囊尾蚴中的生物学功能奠定了基础,同时也为抗猪囊尾蚴病的药物设计和开发提供了研究基础。

关键词： dUTP焦磷酸酶猪囊尾蚴原核表达酶学活性