滑液囊支原体NADH氧化酶酶学活性及粘附特性研究

作     者：李浩然 

作者单位：安徽农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王桂军;于圣青

授予年度：2020年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：滑液囊支原体 NADH氧化酶 酶学活性 粘附特性 

摘      要：滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)主要引起鸡和火鸡的亚临床呼吸系统疾病、蛋壳顶端畸形及关节渗出型滑膜炎。研究表明,参与支原体代谢相关的酶类,不仅在胞浆中发挥酶的功能,而且在细胞膜上协助支原体粘附和入侵宿主细胞方面发挥作用。NADH氧化酶(NADH oxidase,NOX)是一种氧化还原酶,本论文对滑液囊支原体的NOX酶学活性及粘附特性进行研究,为进一步探索NOX在MS致病过程中的作用提供了分子基础。首先,构建NOX表达菌株BL21(pET28a-MSnox),IPTG诱导表达后,SDS-PAGE电泳分析重组MSNOX(rMSNOX)蛋白表达于上清中。Beaver Beads TM His Tag磁珠对上清中rMSNOX蛋白纯化后,获得纯化的rMSNOX蛋白。Western blot鉴定rMSNOX蛋白具有反应原性,ELISA检测抗rMSNOX兔多克隆抗体效价达到1:102 400及抗rMSNOX兔多克隆抗体介导的补体杀菌实验显示杀菌率为86.42%。NOX在O存在下能催化NADH氧化为NAD,OD测定NADH转化量以此衡量NADH氧化酶酶学活性。酶活测定显示rMSNOX蛋白的酶比活力为14.17 IU/mg,最适酶促温度为37℃,最适p H为7.5,双倒数法求得rMSNOX的最大反应速率V为21.8μmol/(L·min),米氏常数K(NADH)为244.0μmol/L。其次,通过Western blot及悬浮免疫荧光鉴定rMSNOX蛋白亚细胞定位,结果表明rMSNOX蛋白主要存在于MS胞浆中,MS膜表面也有少量的分布。间接免疫荧光检测rMSNOX蛋白对DF1细胞的粘附作用,同时支原体菌落计数法测定抗rMSNOX兔多克隆抗体对MS粘附DF1细胞的抑制效率。结果显示,rMSNOX蛋白能特异性粘附DF1细胞,同时抗rMSNOX兔多克隆抗体能显著抑制MS对DF1细胞的粘附作用,抑制率达到67.87%,为进一步分析MSNOX蛋白在MS粘附宿主细胞中的作用机制,采用Western blot和ELISA法检测rMSNOX与宿主细胞的胞外基质蛋白cPlg和Fn的结合作用,结果显示rMSNOX与cPlg和Fn均具有结合活性。综上所述,本论文对MS的NOX蛋白进行体外重组表达,证实其不仅具有NADH氧化酶的活性,在MS的细胞膜上也有少量分布,并且发挥着粘附宿主细胞的生物学功能。该研究为进一步探索NOX在MS致病过程中的作用提供了分子基础。