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过氧化物酶基因PagPRX19对银腺杨‘84K’耐盐性的影响

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浙江农林大学学报 2022年第6期39卷 1163-1172页

作者：黄清晨赖建新黄李超卢孟柱浙江农林大学林业与生物技术学院浙江杭州311300 浙江农林大学省部共建亚热带森林培育国家重点实验室浙江杭州311300

【目的】盐害作为影响植物生长发育的非生物胁迫因子,严重威胁林木生长。在受到盐胁迫时,植物内源活性氧(ROS)水平增加,造成氧化胁迫,影响植株正常生长发育。因此,可通过增强过氧化物酶PRX家族成员表达水平,改变ROS水平,以增强杨树Popu... 详细信息

【目的】盐害作为影响植物生长发育的非生物胁迫因子,严重威胁林木生长。在受到盐胁迫时,植物内源活性氧(ROS)水平增加,造成氧化胁迫,影响植株正常生长发育。因此,可通过增强过氧化物酶PRX家族成员表达水平,改变ROS水平,以增强杨树Populus耐盐能力,揭示PRX成员参与调控杨树盐胁迫响应的机制。【方法】以银腺杨‘84K’Populus alba×P. glandulosa ‘84K’为材料,生物信息学分析选取PRX家族成员PagPRX19进行克隆并构建过表达载体,农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导叶盘转化法获得过表达植株。以银腺杨‘84K’ PagPRX19过表达植株生长45 d的组培苗和生长2个月的土培苗为实验材料,进行盐胁迫处理,以非转基因植株为对照。观察植株表型,检测脯氨酸、丙二醛、电解质渗透率等生理指标并进行分析。【结果】(1)克隆了PagPRX19基因,构建过表达载体,获得转基因阳性植株。经分子鉴定选取2个过表达株系OE#1和OE#2为实验材料做后续分析。(2)与对照相比,过表达植株株高下降,地径增加。(3)盐胁迫处理下,过表达植株相较于对照表现为叶片皱缩以及植株生长受到抑制程度低,组培苗的盐胁迫处理表现为相似结果。(4)转基因植株的ROS水平降低,而且在盐胁迫下过表达植株叶片和根的ROS仍保持较对照低的水平。盐胁迫下过表达植株较对照脯氨酸增加,叶片持水能力增强,丙二醛和电解质渗透率降低。从生理方面显示转基因植株具有较高的耐盐能力。【结论】过表达PagPRX19可降低盐胁迫下杨树转基因植株的ROS水平,缓解氧化胁迫,增强了植株耐盐性。图11参23。

关键词：银腺杨‘84K’ 过氧化物酶内源活性氧(ROS) 盐胁迫耐盐性

过氧化物酶P450BSβ催化无羧基底物的定向进化及潜在应用

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过氧化物酶P450BSβ催化无羧基底物的定向进化及潜在应用

作者：黄梦飞扬州大学

学位级别：硕士

细胞色素P450酶作为广泛存在于自然界的血红素单加氧酶,在药物代谢、异质生物解毒和类固醇生物合成方面发挥重要作用,其在温和条件下高选择性地催化有机化合物中C-H键羟基化反应的特性引起科学家们的广泛关注。大多数P450酶对氧化还原... 详细信息

细胞色素P450酶作为广泛存在于自然界的血红素单加氧酶,在药物代谢、异质生物解毒和类固醇生物合成方面发挥重要作用,其在温和条件下高选择性地催化有机化合物中C-H键羟基化反应的特性引起科学家们的广泛关注。大多数P450酶对氧化还原伴侣和昂贵的辅因子NAD(P)H的双重需求限制其在合成上的应用。虽然来自过氧化物酶家族的P450BSβ利用H2O2分流途径很好地解决这一问题,但该酶较高的底物特异性限制其作为普遍使用的生物催化剂的应用前景。P450Bsβ的催化机制依赖脂肪酸底物的羧基与活性位点Arg242的胍基相互作用形成的盐桥,这是生成高氧化性中间体Compound Ⅰ和启动催化循环的关键。因此,不含羧酸基团的分子不能开启氧化循环,导致P450Bsβ对非羧酸底物几乎没有催化活性。目前通过添加诱饵分子的手段可实现高底物特异性酶对非羧酸底物的催化,但该方法仍存在底物范围狭窄、诱饵分子不易获取和竞争性抑制等问题。开发一个依赖酶内部一般酸碱对实现“自激活”的催化剂具有重要的应用意义。为此,本课题通过向蛋白质框架特定位点引入酸性官能团,代替底物羧基与保守的Arg242的胍基通过静电相互作用形成盐桥,以保证在对非羧酸底物的催化反应中酶自身实现Compound Ⅰ的形成。基于该策略的应用,我们成功获得了无需脂肪酸底物启动氧化循环的“自激活”突变体,打破了 P450Bsβ只能催化带有羧酸基团的天然底物的限制。经过进一步的突变筛选和助溶剂的优化,我们最终获得了 P450BSβ-Q85H/V170E/A246G/G290I这一突变体,该突变体通过廉价易得的H2O2即可以48.3%的转化率较为专一的催化6-苯己酸甲酯底物的苄基位氧化,且酮类副产物控制在10%左右。此外,该突变体成功将其底物范围扩展到一系列不同链长和携带不同官能团的其他非羧酸底物,为扩大P450酶的合成应用提供了理论和实验基础。综上所述,本研究通过定向进化和理性设计的手段成功改变了高底物特异性酶P450Bsβ的底物偏好,进一步推动该酶成为更为广谱的生物催化剂。

关键词：生物催化 P450酶过氧化物酶自激活非羧酸底物

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过氧化物酶（PRX）对杨树耐盐性的影响

过氧化物酶（PRX）对杨树耐盐性的影响

作者：黄清晨浙江农林大学

学位级别：硕士

盐害作为一种影响植物生长发育的非生物胁迫因子,严重威胁我国森林安全。植物在盐胁迫环境下生成活性氧(ROS),ROS不仅参与了盐胁迫响应过程,而且调控植物的生长发育。本研究以银腺杨84K(Populus alba×P.glandulosa)为材料,通过过表达... 详细信息

盐害作为一种影响植物生长发育的非生物胁迫因子,严重威胁我国森林安全。植物在盐胁迫环境下生成活性氧(ROS),ROS不仅参与了盐胁迫响应过程,而且调控植物的生长发育。本研究以银腺杨84K(Populus alba×P.glandulosa)为材料,通过过表达过氧化物酶PRX家族成员PagPRX19,以改变内源过氧化氢(HO)水平,在此基础上分析了杨树耐盐性及相关生理指标变化,从而明确了ROS参与调控杨树盐胁迫,为杨树的分子育种提供理论与技术依据。主要结果如下:1.在Phytozome数据库获取毛果杨(P.trichocarpa)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)PRX家族同源蛋白序列,共获得73个拟南芥和93个毛果杨同源蛋白序列并构建了系统发育树。分析了毛果杨PRX家族同源基因的启动子顺式作用元件、基因结构、保守结构域分析以及组织热议表达。最终确定Potri.004G052100(84K杨同源基因为PagPRX19)进一步进行了研究。2.构建了PagPRX19过表达载体,通过农杆菌介导的叶盘转化法获得转化植株,选取了表达量提高的转基因植株进行表型观察,发现PagPRX19过表达植株的株高低于野生型。茎段DAB和NBT组织化学染色结果显示过表达植株ROS含量减少。3.分别对移栽2个月的PagPRX19过表达植株和对照施加100 m M Na Cl溶液进行盐胁迫处理。与对照相比,过表达植株在遭受盐胁迫后叶片皱缩情况较轻,且植株生长受到抑制程度较低。耐盐相关生理指标检测结果显示:盐胁迫下过表达植株脯氨酸含量较对照增加,叶片持水能力增强,丙二醛含量和电解质渗透率较对照低。这些结果表明过表达植株表现为较强耐盐性。组培苗的盐胁迫处理表现为相似结果,过表达植株较对照整体生长状态好。通过检测ROS水平,发现盐胁迫下过表达植株叶片和根的ROS水平较对照低,可能是耐盐性提高的一个重要原因。综上所述,PagPRX19基因表达水平增加增强了盐胁迫下杨树对ROS清除能力,降低了植物细胞氧化胁迫。一方面细胞膜过氧化程度降低,细胞膜完整性高;另一方面增加了渗透物质脯氨酸的含量,缓解渗透胁迫,从而增强杨树耐盐性。因此,PRX家族成员可作为分子育种的优选基因。

关键词：杨树过氧化物酶 ROS 盐胁迫

烫漂过程中荠菜过氧化物酶失活动力学模型研究

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食品工业科技 2023年第5期44卷 67-73页

作者：吴海燕施晓玲袁秋梅南通科技职业学院江苏南通226007 南通市农业生物技术重点实验室江苏南通226007 南通市食品药品监督检验中心江苏南通226006

采用一级动力学模型、Weibull分布模型、Logistic模型对荠菜烫漂过程中过氧化酶失活动力学模型进行拟合。以决定系数(R^(2))、卡方(x^(2))、均方根误差(RMSE)、精确因子(A_(f))、偏差因子(B_(f))等为评价指标,分析模型的拟合效果。利用... 详细信息

采用一级动力学模型、Weibull分布模型、Logistic模型对荠菜烫漂过程中过氧化酶失活动力学模型进行拟合。以决定系数(R^(2))、卡方(x^(2))、均方根误差(RMSE)、精确因子(A_(f))、偏差因子(B_(f))等为评价指标,分析模型的拟合效果。利用模型预测不同烫漂温度的烫漂工艺条件,同时以维生素C的含量为指标,评价不同烫漂工艺对维生素C含量的影响。结果表明:Logistic模型拟合烫漂过程中荠菜过氧化物失活动力学效果好,拟合精度高,拟合值与实测值偏差小,其决定系数R^(2)为0.9980,x^(2)为0.96×10^(-4),RMSE为0.0097,A_(f)为1.1304,B_(f)为1.0070。在过氧化物酶95%失活的条件下,依据Logistic模型预测,100℃下烫漂20 s,80℃下烫漂287 s,POD相对酶活在0.050±0.001之间;烫漂后维生素C含量也存在显著性差异,高温短时烫漂后的维生素C损失较少。POD失活动力学模型预测烫漂工艺条件,可以减少维生素C等热敏性营养成分损失。

关键词：荠菜过氧化物酶烫漂动力学模型

流动注射-循环催化法同时测定过氧化物酶活性和抗坏血酸浓度

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分析试验室 2023年第4期42卷 533-539页

作者：王奔李永生高秀峰四川大学化学工程学院成都610065 四川大学基础医学与法医学院成都610065

利用一种流动注射-循环催化光度系统评价抗坏血酸(AsA)干扰过氧化物酶(POD)的催化反应机制,发现AsA会导致POD催化的显色产物褪色,使显色反应体系出现一种无响应的延滞期,当AsA消耗完后POD的催化动力学曲线线性响应区斜率及截距分别与PO... 详细信息

利用一种流动注射-循环催化光度系统评价抗坏血酸(AsA)干扰过氧化物酶(POD)的催化反应机制,发现AsA会导致POD催化的显色产物褪色,使显色反应体系出现一种无响应的延滞期,当AsA消耗完后POD的催化动力学曲线线性响应区斜率及截距分别与POD活性和AsA浓度相关。基于此现象,建立了一种同时测定POD活性和AsA浓度的新方法。在优化条件下,该法成功用于多种萝卜中POD活性和AsA浓度的测定。方法的线性范围分别是50~2000 U/L POD和20~350 mg/L AsA,相对标准偏差小于1.4%。

关键词：同时测定过氧化物酶抗坏血酸斜率截距

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类过氧化物酶纳米酶及其分析应用的研究进展

分析化学 2023年第5期51卷 666-680页

作者：王小宇魏辉南京林业大学理学院化学与材料科学系南京大学现代工程与应用科学学院江苏省功能材料设计原理与应用技术重点实验室

在不同的纳米酶中，类过氧化物酶纳米酶因其在生物传感、生物成像和疾病治疗等方面具有良好的应用前景而受到广泛关注。通过将实验与理论计算相结合，一些研究阐明了类过氧化物酶的催化机制及其结构与活性之间的关系。此外，为了能够理... 详细信息

在不同的纳米酶中，类过氧化物酶纳米酶因其在生物传感、生物成像和疾病治疗等方面具有良好的应用前景而受到广泛关注。通过将实验与理论计算相结合，一些研究阐明了类过氧化物酶的催化机制及其结构与活性之间的关系。此外，为了能够理性设计高活性的类过氧化物酶，一些开创性的研究开发了数个可以用于预测活性的描述符。这些研究设计的高活性纳米酶被用于体外和体内分析检测。本文首先概述了类过氧化物酶纳米酶理性设计取得的进展，介绍了类过氧化物酶纳米酶在分析检测中的一些典型应用实例，总结了类过氧化物酶纳米酶亟待解决的关键问题和存在的挑战，并对其发展前景进行了展望。

关键词：纳米酶过氧化物酶催化机制分析应用理性设计评述

双亲聚乙烯醇气凝胶过氧化物酶催化性能及对葡萄糖的传感研究

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分析化学 2022年第4期50卷 535-544页

作者：马崇博周明东北师范大学化学学院多酸与网状材料化学教育部重点实验室动力电池国家地方联合工程实验室纳米生物传感与纳米生物分析吉林省高校重点实验室分析测试中心

利用聚乙烯醇(PVA)为基本骨架，马来酸(MA)为辅助交联剂，合成了具有优异类过氧化物酶活性的双亲气凝胶。通过调整马来酸的用量，使气凝胶表面暴露出大量的羧基和酯基，可分别作为酶促反应的催化活性位点和底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺... 详细信息

利用聚乙烯醇(PVA)为基本骨架，马来酸(MA)为辅助交联剂，合成了具有优异类过氧化物酶活性的双亲气凝胶。通过调整马来酸的用量，使气凝胶表面暴露出大量的羧基和酯基，可分别作为酶促反应的催化活性位点和底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)、多巴胺及过氧化氢(HO)的结合位点。利用此气凝胶高效催化HO氧化TMB的显色反应，建立了葡萄糖的传感检测方法，缓冲体系中的线性检测范围为17.4～80.0μmol/L，检出限(3σ)为17.4μmol/L；稀释人血清中线性检测范围为27.4μmol/L～1.0 mmol/L，检出限(3σ)为27.4μmol/L。利用本方法对人血清中葡萄糖含量进行检测，回收率为96.8%～103.0%，相对标准偏差为0.8%～3.9%，检测结果与商品化血糖仪的检测结果基本一致。本研究创新性地以三维有机气凝胶作为一种新型人工模拟酶，拓宽了人工模拟酶材料的设计思路与合成方式，具有轻量化、机械性能优良等特点，有望用于便携式传感器的构建。

关键词：双亲气凝胶模拟酶过氧化物酶葡萄糖传感便携式传感器

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纳米二氧化铈模拟过氧化物酶的研究进展

食品工业科技 2022年第1期43卷 417-424页

作者：方蕾马永强哈尔滨商业大学食品工程学院黑龙江哈尔滨150076 哈尔滨学院食品工程学院黑龙江哈尔滨150086

过氧化物酶在自然界中广泛分布,其利用过氧化氢来催化各种有机和无机化合物的氧化,在诸多领域得以应用。但由于过氧化物酶属于生物有机材料,存在纯化困难、稳定性差等缺点,也限制了其应用环境。纳米酶作为一种高效、简单、稳定、高性能... 详细信息

过氧化物酶在自然界中广泛分布,其利用过氧化氢来催化各种有机和无机化合物的氧化,在诸多领域得以应用。但由于过氧化物酶属于生物有机材料,存在纯化困难、稳定性差等缺点,也限制了其应用环境。纳米酶作为一种高效、简单、稳定、高性能的天然酶替代物在各种应用中得到了广泛的研究,克服了天然酶在工业等方面的实际局限性,其中纳米二氧化铈(CeO_(2)NPs)由于具有过氧化物酶特性已成为科学界研究的热点之一。本文综述了近几年纳米二氧化铈模拟过氧化物酶在食品分析、生物标志物的检测、医学、光学传感、仿生等方面应用的研究进展,显示出它在不同研究领域的巨大潜力,希望能为后续进一步研究提供一定的参考。

关键词：纳米二氧化铈过氧化物酶模拟酶应用

过氧化物酶及其模拟物在食品分析中的应用研究进展

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食品安全质量检测学报 2021年第21期12卷 8494-8500页

作者：徐阳辛嘉英王雨晴王贵儒尹一哈尔滨商业大学食品科学与工程重点实验室哈尔滨150076 中国科学院兰州物理化学研究所羰基合成与选择氧化国家重点实验室兰州730000

过氧化物酶是一类在自然界中广泛存在的天然生物酶,可催化过氧化氢参与的各种氧化还原反应,因此经常被用来检测食品中过氧化氢、葡萄糖、血浆中胆固醇等,还可用于检测谷胱甘肽、半胱氨酸等大分子物质,广泛应用于食品检测和加工领域。但... 详细信息

过氧化物酶是一类在自然界中广泛存在的天然生物酶,可催化过氧化氢参与的各种氧化还原反应,因此经常被用来检测食品中过氧化氢、葡萄糖、血浆中胆固醇等,还可用于检测谷胱甘肽、半胱氨酸等大分子物质,广泛应用于食品检测和加工领域。但由于天然过氧化物酶存在稳定性差、易受外界环境影响、在酸碱环境下易失活等缺点,而模拟酶因其稳定性强、耐酸、耐碱等优势而成为天然酶的高效替代品,可代替天然过氧化物酶高效率的完成许多催化反应。目前,使用模拟酶代替天然过氧化物酶已成为研究热点,已广泛应用于食品中有害残留物质的检测,为保障食品安全、维护人体健康,模拟酶的研究已成为一种趋势。本研究综述了常见的过氧化物模拟酶催化机理,以及其在食品分析中的应用研究进展,并对其应用前景和发展方向进行展望,以期为今后模拟酶的合成提供新思路,为保障食品安全提供新方法。

关键词：过氧化物酶模拟酶食品分析