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转录因子e2f1在fLT3-ITD突变的急性髓系白血病细胞中的功能及其机制研究

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转录因子E2F1在FLT3-ITD突变的急性髓系白血病细胞中的功能及其机...

作者：欧子瑶安徽医科大学

学位级别：硕士

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）是一种异质性的血液学侵袭性骨髓肿瘤,其特征是分化和功能缺陷的前体髓系细胞的不可逆扩张,白血病细胞在特定的造血分化阶段表现出成熟阻滞,表征为不同的白血病亚型,根据fAB分类分为M0-M7... 详细信息

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）是一种异质性的血液学侵袭性骨髓肿瘤,其特征是分化和功能缺陷的前体髓系细胞的不可逆扩张,白血病细胞在特定的造血分化阶段表现出成熟阻滞,表征为不同的白血病亚型,根据fAB分类分为M0-M7。根据研究,AML主要存在以下两类突变基因,一类是与血液细胞无法正常分化相关的基因,另一类是与非成熟血液细胞异常增殖相关基因,包括fLT3。fLT3是一种受体酪氨酸激酶,在正常造血干细胞的生理过程中起着调节作用,并在AML细胞中表达,fLT3基因突变是中危AML患者中最常见的突变之一,其位于染色体13q12上,包含24个外显子。fLT3基因的突变发生在约24%的成人AML患者中。其中2/3总数的突变是近膜结构域的内部串联复制（ITD）,fLT3-ITD基因是一种原癌基因,其突变可以引起恶性细胞的异常扩增,通过对酪氨酸激酶区的活化作用,使fLT3自身磷酸化从而导致多个信号通路被激活,促进AML疾病的进展。e2f家族是细胞周期调控中极其重要的核转录因子,目前已经被发现的有八个基因,包括e2f1-8。其家族成员都包含一个DNA结合结构域（DBD）与基因启动子结合,从而开始转录过程。e2f1除了被报道参与调节细胞周期进程外,并已经被证明通过p53依赖的方式调节细胞死亡,并在其他细胞过程中发挥着关键作用。e2f1仍然是一个有争议的预后因素,但其在疾病中的高表达与细胞增殖密切相关,并影响着临床结局。数据库及临床分析发现,除脑癌和中枢神经系统癌外,e2f1在大多数实体肿瘤中均发现过表达,如肝癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌、肾癌、卵巢癌等。转录因子e2f1除了在调控包括细胞周期阻滞和凋亡在内的关键细胞过程中发挥着重要作用外,也有文献报道e2f1与细胞能量代谢密切相关。前期预实验结果提示:e2f1在AML患者中表达异常上调,尤其是在携带fLT3-ITD突变的AML患者中。本研究旨在阐明e2f1基因在fLT3-ITD突变的AML中的作用及可能的分子机理,并为AML的潜在治疗提供可能的靶点。目的:本文旨在探究e2f1在fLT3-ITD突变的AML细胞分化和增殖过程中的作用及相关分子机制。方法:1.e2f1在fLT3-ITDAML细胞和患者样本中的表达以及在CD34HSPCs体外分化过程中的表达情况使用Western blot检测健康受试者、AML患者外周血样本中e2f1基因的表达差异。体外培养fLT3-ITD阳性细胞株Molm-13、Mv4-11,以及fLT3-ITD阴性细胞株THP-1,采用Western blot、q-PCR检测三种突变程度不同细胞株中e2f1基因m RNA和蛋白水平的变化情况。采用高梯度磁细胞分选系统（MACS）从脐带血中分离出CD34阳性细胞,在液体培养体系中用造血生长因子G-CSf和IL-3诱导分化,在不同时间点采用q-PCR法检测CD34HSPCs细胞在髓系分化过程中e2f1的表达变化。2.e2f1基因的敲低和过度表达对AML细胞增殖和分化的影响我们分别转染两种独立的慢病毒短发夹RNA（sh e2f1#1和sh e2f1#2）,构建稳定沉默的细胞模型,利用Ubi-e2f1-MCS-SV40-PURO慢病毒构建了e2f1的外源稳定表达细胞。q-PCR检测e2f1的表达情况,确定细胞模型构建成功后,Western blot检测细胞增殖相关基因（PCNA、CDK2）的蛋白表达水平,CCK-8检测细胞的增殖活性,Ki-67荧光染色评估细胞增殖情况,流式细胞术（flow Cytometry,fCM）测定细胞周期进展以及细胞分化比例,瑞氏-吉姆萨染色观察细胞核的收缩情况,集落形成实验（CfU）测定细胞的克隆能力。***3-ITD对e2f1的调控作用,以及e2f1基因的敲低对fLT3-ITD驱动的HSCPs和AML细胞过度增殖的影响使用fLT3-ITD的特异性磷酸酶抑制AC220处理不同时间点之后,Western blot、q-PCR检测e2f1基因的蛋白和m RNA的水平变化,构建慢病毒系统诱导fLT3-ITD在人CD34HSPCs和THP-1细胞（fLT3-WT）中异位表达,Western blot检测细胞增殖相关基因（PCNA、CDK2）的蛋白表达水平,CCK-8检测细胞的增殖活性,免疫荧光染色检测e2f1的表达情况,集落形成实验（CfU）测定细胞的克隆能力。4.染色质免疫沉淀后测序（Ch IP-Seq）分析e2f1基因在fLT3-ITDAML中的作用免疫荧光染色检测fLT3-ITD过表达对e2f1表达的影响,使用细胞核质分离试剂盒分别提取细胞的核质蛋白并进行验证,激光共聚焦观察e2f1的荧光变化情况,取样本细胞后进行Ch IP实验,收集纯化后的DNA,低温保存送至测序服务机构进

关键词：转录因子e2f1 fLT3-ITD突变急性髓系白血病嘌呤代谢

转录因子e2f1调控小细胞肺癌凋亡机制的研究

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实用医学杂志 2014年第22期30卷 3573-3575页

作者：苏珊黄惠怡邹建军岑文昌张贤兰广州市胸科医院肿瘤科 510095 南方医科大学

目的:探讨转录因子e2f1对人小细胞肺癌细胞株H446的凋亡调节作用。方法:构建转录因子e2f1的重组质粒,经脂质体导入H446细胞,分别设置空白对照组、阴性对照组。采用适时定量PCR法和免疫印迹法(western-blot)检测转染前后细胞转录因子e2f1... 详细信息

目的:探讨转录因子e2f1对人小细胞肺癌细胞株H446的凋亡调节作用。方法:构建转录因子e2f1的重组质粒,经脂质体导入H446细胞,分别设置空白对照组、阴性对照组。采用适时定量PCR法和免疫印迹法(western-blot)检测转染前后细胞转录因子e2f1的m RNA与蛋白表达的变化,以及抗凋亡蛋白BCL-2的表达水平。同时采用流式细胞仪技术检测转染前后细胞凋亡率的变化。结果:成功建立e2f1干扰的小细胞肺癌细胞株,其e2f1蛋白表达较空白对照及未转染组明显降低。转染后的细胞株凋亡率较转染前及空白对照组明显下降(P转录因子e2f1在小细胞肺癌细胞株H446中起促进凋亡的作用,有可能通过影响抗凋亡蛋白Bcl-2的表达参与调控细胞凋亡过程。

关键词：小细胞肺癌凋亡转录因子e2f1

转录因子e2f1调节脂肪间充质干细胞的旁分泌功能及其促进皮肤创面愈合的研究

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转录因子E2F1调节脂肪间充质干细胞的旁分泌功能及其促进皮肤创面...

作者：仪臻华中科技大学

学位级别：硕士

目的:探索e2f1对脂肪间充质干细胞(Adipose mesenchymal stem cells,ADSCs)旁分泌功能的影响,e2f1ADSCs对小鼠创面愈合进程的作用及其相关的作用机制。方法:选取6-8周龄野生型(WT)和e2f1基因敲除(e2f1)小鼠,分离培养WT ADSCs和e2f1ADSCs... 详细信息

目的:探索e2f1对脂肪间充质干细胞(Adipose mesenchymal stem cells,ADSCs)旁分泌功能的影响,e2f1ADSCs对小鼠创面愈合进程的作用及其相关的作用机制。方法:选取6-8周龄野生型(WT)和e2f1基因敲除(e2f1)小鼠,分离培养WT ADSCs和e2f1ADSCs,培养至第4代(P4),显微镜下观察比较两组细胞形态,并采用流式细胞术对ADSCs相关特异性表面标志物分子进行鉴定,经成脂分化诱导,行油红O染色。建立WT小鼠背部全层皮肤缺损创面模型,实验设置为三组,分别给予:(1)磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)注射;(2)WT ADSCs;(3)e2f1ADSCs。记录不同愈合时段(0 d、3 d、7 d、10d、14 d)创面愈合情况,并计算各组创面愈合率,比较各组在不同时间点创面愈合速度的差别;术后14天,He染色观察并比较各组愈合情况;Masson染色评估各组创面新生皮肤组织胶原沉积情况。Ki67(绿色荧光)与CD31(红色)免疫荧光染色,观察各组新生血管的增殖情况;TUNeL荧光染色比较各组创面细胞的凋亡差异。免疫组化检测VeGf、TGf-β1和α-SMA的在创面组织中的表达。采用蛋白免疫印迹法(Western blotting,WB)测定α-SMA、Collagen I、VeGf和TGf-β1的蛋白表达情况。将WT ADSCs和e2f1ADSCs在常氧(Normoxia,20%)和缺氧(Hypoxia,2%)条件下培养24小时,即分为4组:(1)WT Normoxia;(2)WT Hypoxia;(3)e2f1Normoxia;(4)e2f1Hypoxia,采用WB和免疫荧光实验检测检测各组细胞VeGf和TGf-β1的蛋白表达情况。收集各组ADSCs的细胞培养上液(ADSC-conditioned medium,ADSC-CM)。观察各组细胞培养上清对小鼠真皮成纤维细胞增殖和迁移的影响,以及对小鼠主动脉内皮细胞(Mouse aortic endothelial cells,MAeCs)成管能力的影响。结果:WT ADSCs和e2f1ADSCs在体外均能稳定传代,镜下观察为长梭形呈典型的成纤维样细胞形态。细胞表面标志物CD29、CD44、CD90为阳性而CD31为阴性,经成脂诱导及油红O染色呈现典型的成熟脂肪细胞形态特征。在动物模型中,e2f1ADSCs注射组,创面愈合速度最快,其次分别为WT ADSCs组和Control组;对应地,He染色和Masson染色结果均显示e2f1ADSCs组创口间隙最小,胶原蛋白沉积最为明显,其次分别为WT ADSCs组和Control组。免疫荧光的结果显示,e2f1ADSCs组中处于增殖期的新生血管密度最大,细胞凋亡最少。免疫组化的结果显示,e2f1ADSCs组的组织中α-SMA、VeGf和TGf-β1表达最多,显著优于WT ADSCs组和Control组(Pestern blotting结果显示,VeGf、TGf-β1、α-SMA和Collagen I等蛋白的表达水平在三组中相比较,均为e2f1ADSCs>WT ADSCs组>Control组(Pestern blotting及免疫荧光结果表明,无论在常氧或缺氧的条件下,相比于WT ADSCs,敲除e2f1的ADSCs中VeGf和TGf-β1的表达量均明显升高(PeGf和TGf-β1的蛋白表达量分别为,e2f1Hypoxia ADSCs>e2f1Normoxia ADSCs>WT Hypoxia ADSCs>WT Normoxia ADSCs。e2f1Hypoxia组的培养上清对MAeCs的成管能力、成纤维细胞增殖和迁移能力具有最大的促进作用,强于Hyp-WT ADSCs-CM;同时,在常氧组,Nor-e2f1ADSCs-CM的作用也高于Nor-WT ADSCs-CM。结论:敲除e2f1能够上调ADSCs旁分泌细胞因子中VeGf和TGf-β1的表达,促进成纤维细胞的增殖和迁移,内皮细胞成管。敲除e2f1的ADSCs能够更好的促进小鼠创面血管化和胶原沉积,加快创面愈合进程。转录因子e2f1是调节ADSCs的旁分泌作用的重要靶点,抑制e2f1的表达可以增强ACSCs的旁分泌功能,能够有效提高细胞治疗效果。

关键词：创面愈合干细胞疗法转录因子e2f1 脂肪间充质干细胞细胞生长因子

肝癌细胞系中miR-9和转录因子e2f1的表达及其与药物敏感性的关系

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现代肿瘤医学 2021年第23期29卷 4102-4107页

作者：夏云展李荣振杨金花李琼郑州人民医院普通外科河南郑州450000 郑州人民医院病理科河南郑州450000 郑州人民医院神经内科河南郑州450000

目的:研究肝癌细胞系中微小RNA(microRNA,miR)-9和转录因子e2f1的表达及其与药物敏感性的关系。方法:体外培养肝细胞系HL-7702,肝癌细胞系HepG2、Hep3B2.1-7,处理细胞分miRNA NC组、miR-9 inhibitor组、顺铂(CDDP)组、CDDP+miRNA NC组、CDDP+miR-9 inhibitor组。实时荧光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测miR-9表达水平;免疫印记(Western blot,WB)法检测e2f1蛋白水平;CCK-8法检测miR-9对细胞存活的影响;克隆计数检测miR-9对细胞数量的影响。结果:与正常肝细胞系HL-7702相比,肝癌细胞系HepG2、Hep3B2.1-7中miR-9、e2f1蛋白水平升高(PepG2、Hep3B2.1-7细胞系中,与miRNA NC组相比,miR-9 inhibitor组、CDDP+miR-9 inhibitor组miR-9、e2f1蛋白表达水平、细胞克隆数量降低(Pe2f1蛋白表达水平、细胞克隆数量升高(Pe2f1蛋白表达水平、细胞克隆数量降低(PepG2细胞系中,与miRNA NC组、CDDP组、CDDP+miRNA NC组相比,miR-9 inhibitor组、CDDP+miR-9 inhibitor组(12、24、48 h)细胞OD450降低(Pep3B2.1-7细胞系中,与miRNA NC组相比,miR-9 inhibitor组(12、24、48 h)、CDDP+miR-9 inhibitor组(6、12、24、48 h)细胞OD450降低(P2、24、48 h)、CDDP+miR-9 inhibitor组(3、6、12、24、48 h)细胞OD450降低(P24、48 h)、CDDP+miR-9 inhibitor组(12、24、48 h)细胞OD450降低(PepG2、Hep3B2.1-7中miR-9和e2f1表达上调;干扰miR-9可抑制e2f1表达,抑制细胞增殖、抑制细胞克隆形成,提高药物敏感性。

关键词：微小RNA-9 转录因子e2f1 药物敏感性

转录因子e2f1及其突变体真核表达质粒的构建及稳定表达细胞株的建立

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生物化工 2021年第3期7卷 44-46页

作者：安娇朱长军王雅洁天津师范大学生命科学学院天津300387 天津师范大学天津市动植物抗性重点实验室天津300387

通过细胞转染、药物筛选等方法,获得flag-e2f1和flag-e2f1e132稳定表达的HeLa细胞株,用蛋白印迹杂交和细胞免疫荧光染色的方法对其进行鉴定。结果表明,本研究构建了flag-e2f1和flag-e2f1e132稳定表达的HeLa细胞株,这些稳筛细胞株对于进... 详细信息

通过细胞转染、药物筛选等方法,获得flag-e2f1和flag-e2f1e132稳定表达的HeLa细胞株,用蛋白印迹杂交和细胞免疫荧光染色的方法对其进行鉴定。结果表明,本研究构建了flag-e2f1和flag-e2f1e132稳定表达的HeLa细胞株,这些稳筛细胞株对于进一步寻找e2f1的关键下游靶基因十分重要。

关键词：转录因子e2f1 定点突变稳定表达细胞株

细胞转录因子e2f1对下游基因的调控及其生物学功能研究

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细胞转录因子E2F1对下游基因的调控及其生物学功能研究

作者：李杨华东师范大学

学位级别：硕士

细胞内重要的转录因子e2f1是e2f家族中第一个被克隆出来的蛋白,对细胞的增殖、分化和凋亡都发挥着关键性的作用。e2f1参与了细胞周期从G1期到S期的转换：在细胞周期G1期前,Rb与e2f1结合限制了其活性,当细胞周期蛋白激酶CDK结合蛋白Rb后... 详细信息

细胞内重要的转录因子e2f1是e2f家族中第一个被克隆出来的蛋白,对细胞的增殖、分化和凋亡都发挥着关键性的作用。e2f1参与了细胞周期从G1期到S期的转换：在细胞周期G1期前,Rb与e2f1结合限制了其活性,当细胞周期蛋白激酶CDK结合蛋白Rb后,磷酸化的Rb释放e2f1/DP-1复合物,这样e2f1/DP-1就结合到基因组上,发挥转录调控功能激活下游基因,进而使细胞周期从G1期转换到S期。同时,e2f1还发挥促凋亡功能,通过p53依赖型以及p53非依赖型两种细胞信号通路,进而激活下游促凋亡蛋白如：Bcl-2 homology3(BH3)-only proteins PUMA, Noxa, Bim, Hrk/DP5,Bik以及Caspase-3,-9等;此外,e2f1还抑制细胞存活信号通路分子如：Nf-κB,Mcl-1等。通过e2f1这两方面的作用,最终带来细胞的凋亡。因此,转录因子e2f1与肿瘤的治疗有很密切的关系,以e2f1作为肿瘤药物靶点的研究显得尤为重要。由于转录因子e2f1在细胞周期和细胞凋亡中发挥着关键性的作用,为了研究e2f1对其下游基因的调控,本论文利用稳定表达eR-e2f1即雌激素受体与e2f1的融合蛋白的H1299细胞株进行研究。该细胞株能够稳定表达大量融合蛋白eR-e2f1,这样细胞内这些融合蛋白就会与细胞膜上的大量配体相结合,从而将eR-e2f1固定在细胞核之外。当加入雌激素受体抑制剂(4-OHT)处理一段时间后,eR-e2f1与细胞膜上的配体的结合就会被打断,大量的eR-e2f1就会进入细胞核内发挥e2f1的转录调控功能。本论文首先是建立并通过G418筛选出稳定表达HA-eR-e2f1融合蛋白的H1299细胞株;其次,在雌激素受体抑制剂(4-OHT):处理的情况下,通过western blot技术检测发现e2f1能够在蛋白水平上激活下游蛋白DP-1和B-Raf;再次,用细胞株H1299和Hela,在瞬时转染质粒HA-e2f1的情况下,通过western blot技术和免疫荧光染色技术分别证实e2f1在蛋白水平上激活下游蛋白DP-1和B-Raf;最后,利用H1299细胞株,在瞬时转染质粒HA-e2f1的情况下,通过Rt-PCR技术检测发现,e2f1在转录水平上激活DP-1.在本论文所建立的e2f1对其下游基因调控的稳定表达系统中,融合蛋白eR-e2f1在细胞内是大量表达的,我们只是通过雌激素受体抑制剂(4-OHT)来改变该蛋白的细胞空间定位,进而在人为可控的情况下来研究e2f1对其下游基因的调控。我们的结果第一次揭示了e2f1蛋白与其下游蛋白DP-1之间的关系,这对于研究e2f1/DP-1异二聚体的形成与功能具有重要意义;同时,本论文所揭示的e2f1蛋白与B-Raf蛋白的关系,对于探讨e2f1与细胞周期以及细胞肿瘤的关系具有一定的积极意义。

关键词： eR-e2f1 雌激素受体抑制剂转录因子e2f1 DP-1 B-Raf

组蛋白去乙酰化酶HDAC11对转录因子e2f1的蛋白稳定性及转录活性调控研究

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组蛋白去乙酰化酶HDAC11对转录因子E2F1的蛋白稳定性及转录活性调...

作者：高晓静华东师范大学

学位级别：硕士

e2f1是细胞内重要的转录激活因子,在细胞周期和细胞凋亡调控方面都发挥了重要作用。在细胞正常分裂时,e2f1参与了细胞周期从G1期到S期的转换。细胞处于非分裂期时,Rb与e2f1结合限制了其活性。当细胞开始进入分裂期时,周期蛋白激酶CDK结... 详细信息

e2f1是细胞内重要的转录激活因子,在细胞周期和细胞凋亡调控方面都发挥了重要作用。在细胞正常分裂时,e2f1参与了细胞周期从G1期到S期的转换。细胞处于非分裂期时,Rb与e2f1结合限制了其活性。当细胞开始进入分裂期时,周期蛋白激酶CDK结合口袋蛋白Rb后,磷酸化的Rb释放e2f1/DP-1复合物,游离的e2f1/DP-1被激活,结合到基因组上,发挥转录调控功能,细胞通过细胞周期检验点。同时,e2f1还参与细胞凋亡。当细胞DNA损伤时,e2f1被激活,转录活性大大增强,可以诱导下游凋亡蛋白的转录,并通过p53依赖性以及p53非依赖性两条细胞信号通路诱导凋亡的发生。e2f1发挥激活作用的前提是高度乙酰化。CBP可使e2f1高度乙酰化,转录活性大大增强,而Rb又可通过招募HDAC1来抑制e2f1的乙酰化,从而抑制转录活性。因此e2f1的乙酰化调控对e2f1的功能调控十分重要,功能紊乱则会导致细胞恶性增殖,诱导肿瘤的发生。组蛋白去乙酰化酶HDAC11属于组蛋白去乙酰化酶家族成员,含有去乙酰化酶保守区域,结构极其简单,现被单独列出,属于HDAC家族的第四类。它在人体器官中的分布具有很大差异性,在大脑,心脏,肾脏,骨骼肌中含量丰富,而在其它器官组织中表达甚低。在胚胎大脑发育过程中,HDAC11的表达呈先上升后下降的趋势,这说明HDAC11在神经系统的正常发育过程中可能起到了重要的作用。另外研究发现HDAC11在免疫系统中也起到关键作用,对应答免疫耐受中相关因子IL-10起到抑制作用。越来越多的研究发现,HDAC11参与多项生理功能,在人体正常生理和代谢中起到一定的作用。本论文通过一系列实验发现HDAC11是e2f1的结合蛋白之一,可以调控e2f1的乙酰化水平,影响e2f1的蛋白稳定性及转录活性。首先我们通过免疫共沉淀实验发现HDAC11可结合于e2f1的特定区域,降低e2f1的蛋白稳定性,并且使e2f1降解速率加快。通过e2f1的转录活性实验的检测,我们发现HDAC11可抑制e2f1的转录活性。另外HDAC11与e2f1结合后使其e2f1的乙酰化水平降低,泛素化水平提高。上述实验结果提示我们HDAC11可作为e2f1的重要调控蛋白质一,通过抑制其乙酰化水平,影响e2f1的蛋白稳定性及及其转录活性,对细胞周期及细胞凋亡也具有一定的调控。这一结论有助于我们进一步探究HDAC11在肿瘤发生发展中的相关作用,同时为肿瘤治疗提供了新的可能药物靶点。

关键词： HDAC11 乙酰化转录因子e2f1 细胞周期细胞凋亡

转录因子e2f1和PCNA在分离、培养的人视网膜色素上皮细胞中的表达及意义

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中国组织化学与细胞化学杂志 2001年第2期10卷 146-149页

作者：李晓青曾水清徐莉莉吕源淑同济医科大学协和医院眼科武汉430022

为探讨转录因子 e2 f1及增殖细胞核抗原 (PCN A)在增生性玻璃体视网膜病变 (PVR)中的作用 ,采用 SABC免疫细胞化学法检测转录因子 e2 f1和 PCNA在无血清组及 2 0 %血清组培养的人视网膜色素上皮细胞 (RPe)中的表达。结果显示在无血清组... 详细信息

为探讨转录因子 e2 f1及增殖细胞核抗原 (PCN A)在增生性玻璃体视网膜病变 (PVR)中的作用 ,采用 SABC免疫细胞化学法检测转录因子 e2 f1和 PCNA在无血清组及 2 0 %血清组培养的人视网膜色素上皮细胞 (RPe)中的表达。结果显示在无血清组中 ,转录因子 e2 f1表达的阳性率为 2 .4%± 0 .2 5 % ,而未见 PCNA表达 ;在 2 0 %血清组中 ,e2 f1及 PCNA的表达阳性率分别为 2 9.1%± 0 .71%和 48.6 %± 1.13%。说明 e2 f1和 PCNA蛋白的表达取决于人 RPe细胞的生长状态 ,在增殖活跃的细胞中表达增高 ;转录因子 e2 f1调控人 RPe细胞中 PCNA蛋白的表达。提示转录因子 e2 f1调控人 RPe细胞的细胞周期进展 ,在

关键词：转录因子e2f1 PCNA 分离培养表达增殖细胞核抗原视网膜色素上皮细胞免疫组织化学人 PVR

特异性小分子RNA沉默转录因子e2f-1表达对小鼠精原干细胞凋亡的影响

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中华实验外科杂志 2014年第7期31卷 1533-1535页

作者：曾汉青朱朝辉万锋王进李森张友朋华中科技大学同济医学院附属协和医院泌尿外科武汉430022

目的观察小分子干扰RNA（siRNA）沉默转录因子e2f-1表达对小鼠精原干细胞（SSCs）凋亡的影响。方法采用Percoll液密度梯度离心分离和流式细胞仪分选纯化SSCs进行体外培养,以脂质体法转染pSilencer4.1-e2f1至SSCs,并用实时定量逆转录... 详细信息

目的观察小分子干扰RNA（siRNA）沉默转录因子e2f-1表达对小鼠精原干细胞（SSCs）凋亡的影响。方法采用Percoll液密度梯度离心分离和流式细胞仪分选纯化SSCs进行体外培养,以脂质体法转染pSilencer4.1-e2f1至SSCs,并用实时定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）和Western blot检测e2f-1的表达水平,流式细胞仪检测siRNA干扰e2f-1表达后对SSCs凋亡的影响。结果 RT-qPCR结果实验组mRNA的2ΔΔCt值（0.32）明显低于未转染组（0.10）和阴性对照组（1.04）,Western blot显示实验组条带灰度低于未转染组和阴性对照组,流式细胞术检测显示实验组凋亡率（7.69%）低于未转染组（23.07%）和阴性对照组（24.19%）,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论 siRNA靶向干扰转录因子e2f-1能显著降低小鼠SSCs的凋亡率。

关键词： RNA干扰精原干细胞转录因子e2f1 脱噬作用