转录因子E2F1在FLT3-ITD突变的急性髓系白血病细胞中的功能及其机制研究

作     者：欧子瑶 

作者单位：安徽医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈飞虎

授予年度：2023年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：转录因子E2F1 FLT3-ITD突变 急性髓系白血病 嘌呤代谢 

摘      要：急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）是一种异质性的血液学侵袭性骨髓肿瘤,其特征是分化和功能缺陷的前体髓系细胞的不可逆扩张,白血病细胞在特定的造血分化阶段表现出成熟阻滞,表征为不同的白血病亚型,根据FAB分类分为M0-M7。根据研究,AML主要存在以下两类突变基因,一类是与血液细胞无法正常分化相关的基因,另一类是与非成熟血液细胞异常增殖相关基因,包括FLT3。FLT3是一种受体酪氨酸激酶,在正常造血干细胞的生理过程中起着调节作用,并在AML细胞中表达,FLT3基因突变是中危AML患者中最常见的突变之一,其位于染色体13q12上,包含24个外显子。FLT3基因的突变发生在约24%的成人AML患者中。其中2/3总数的突变是近膜结构域的内部串联复制（ITD）,FLT3-ITD基因是一种原癌基因,其突变可以引起恶性细胞的异常扩增,通过对酪氨酸激酶区的活化作用,使FLT3自身磷酸化从而导致多个信号通路被激活,促进AML疾病的进展。E2F家族是细胞周期调控中极其重要的核转录因子,目前已经被发现的有八个基因,包括E2F1-8。其家族成员都包含一个DNA结合结构域（DBD）与基因启动子结合,从而开始转录过程。E2F1除了被报道参与调节细胞周期进程外,并已经被证明通过p53依赖的方式调节细胞死亡,并在其他细胞过程中发挥着关键作用。E2F1仍然是一个有争议的预后因素,但其在疾病中的高表达与细胞增殖密切相关,并影响着临床结局。数据库及临床分析发现,除脑癌和中枢神经系统癌外,E2F1在大多数实体肿瘤中均发现过表达,如肝癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌、肾癌、卵巢癌等。转录因子E2F1除了在调控包括细胞周期阻滞和凋亡在内的关键细胞过程中发挥着重要作用外,也有文献报道E2F1与细胞能量代谢密切相关。前期预实验结果提示:E2F1在AML患者中表达异常上调,尤其是在携带FLT3-ITD突变的AML患者中。本研究旨在阐明E2F1基因在FLT3-ITD突变的AML中的作用及可能的分子机理,并为AML的潜在治疗提供可能的靶点。目的:本文旨在探究E2F1在FLT3-ITD突变的AML细胞分化和增殖过程中的作用及相关分子机制。方法:1.E2F1在FLT3-ITDAML细胞和患者样本中的表达以及在CD34HSPCs体外分化过程中的表达情况使用Western blot检测健康受试者、AML患者外周血样本中E2F1基因的表达差异。体外培养FLT3-ITD阳性细胞株Molm-13、Mv4-11,以及FLT3-ITD阴性细胞株THP-1,采用Western blot、q-PCR检测三种突变程度不同细胞株中E2F1基因m RNA和蛋白水平的变化情况。采用高梯度磁细胞分选系统（MACS）从脐带血中分离出CD34阳性细胞,在液体培养体系中用造血生长因子G-CSF和IL-3诱导分化,在不同时间点采用q-PCR法检测CD34HSPCs细胞在髓系分化过程中E2F1的表达变化。2.E2F1基因的敲低和过度表达对AML细胞增殖和分化的影响我们分别转染两种独立的慢病毒短发夹RNA（sh E2F1#1和sh E2F1#2）,构建稳定沉默的细胞模型,利用Ubi-E2F1-MCS-SV40-PURO慢病毒构建了E2F1的外源稳定表达细胞。q-PCR检测E2F1的表达情况,确定细胞模型构建成功后,Western blot检测细胞增殖相关基因（PCNA、CDK2）的蛋白表达水平,CCK-8检测细胞的增殖活性,Ki-67荧光染色评估细胞增殖情况,流式细胞术（Flow Cytometry,FCM）测定细胞周期进展以及细胞分化比例,瑞氏-吉姆萨染色观察细胞核的收缩情况,集落形成实验（CFU）测定细胞的克隆能力。***3-ITD对E2F1的调控作用,以及E2F1基因的敲低对FLT3-ITD驱动的HSCPs和AML细胞过度增殖的影响使用FLT3-ITD的特异性磷酸酶抑制AC220处理不同时间点之后,Western blot、q-PCR检测E2F1基因的蛋白和m RNA的水平变化,构建慢病毒系统诱导FLT3-ITD在人CD34HSPCs和THP-1细胞（FLT3-WT）中异位表达,Western blot检测细胞增殖相关基因（PCNA、CDK2）的蛋白表达水平,CCK-8检测细胞的增殖活性,免疫荧光染色检测E2F1的表达情况,集落形成实验（CFU）测定细胞的克隆能力。4.染色质免疫沉淀后测序（Ch IP-Seq）分析E2F1基因在FLT3-ITDAML中的作用免疫荧光染色检测FLT3-ITD过表达对E2F1表达的影响,使用细胞核质分离试剂盒分别提取细胞的核质蛋白并进行验证,激光共聚焦观察E2F1的荧光变化情况,取样本细胞后进行Ch IP实验,收集纯化后的DNA,低温保存送至测序服务机构进