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家蚕追寄蝇寄生蚕体的血液蛋白质差异表达分析及质谱鉴定

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蚕业科学 2014年第4期40卷 633-638页

作者：高丽许平震张美蓉何庆玲陈立华罗旭芳徐安英江苏科技大学江苏镇江212003 中国农业科学院蚕业研究所农业部蚕桑遗传改良重点开放实验室江苏镇江212018

由家蚕追寄蝇(Exorista sorbillans)寄生于家蚕幼虫体壁与肌肉间引起的多化性蚕蛆病对蚕业生产危害极大。基于家蚕血液在蚕体基础代谢、生长发育及先天免疫中的重要功能,采用双向电泳(2-DE)技术检测被家蚕追寄蝇寄生的家蚕5龄幼虫至蛹期... 详细信息

由家蚕追寄蝇(Exorista sorbillans)寄生于家蚕幼虫体壁与肌肉间引起的多化性蚕蛆病对蚕业生产危害极大。基于家蚕血液在蚕体基础代谢、生长发育及先天免疫中的重要功能,采用双向电泳(2-DE)技术检测被家蚕追寄蝇寄生的家蚕5龄幼虫至蛹期第2天的血液蛋白质表达变化,并对表达水平具有显著差异的蛋白点进行质谱鉴定,明确家蚕在受到追寄蝇感染时与免疫应答以及生理、病理变化过程有关的血液蛋白质。在被追寄蝇寄生的蚕体血液中共检测到24个具有显著表达差异的蛋白点,表达上调的蛋白点有17个,包括在家蚕先天免疫系统中发挥重要作用的肽聚糖识别蛋白-S1、C-型凝集素-10和酚氧化酶-2等;表达下调的蛋白点有7个,包括与家蚕生长发育、体内物质代谢等生物学过程相关的蛋白质。血液蛋白质的表达变化提示,当蚕体受到追寄蝇感染时其先天免疫系统被激活,生长发育和体内物质代谢等也受到影响。

关键词：家蚕多化性蚕蛆病血液差异表达蛋白双向电泳质谱鉴定

龙井43号多酚氧化酶同工酶质谱鉴定与酶性质研究

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龙井43号多酚氧化酶同工酶质谱鉴定与酶性质研究

作者：张书芹华中农业大学

学位级别：硕士

多酚氧化酶(PPO)多年来一直是国内外研究的热点,对茶叶品质的形成起关键作用,然而目前缺乏深入开展PPO单一同工酶的研究。本课题以龙井43号为材料,通过硫酸铵沉淀、离子交换层析、凝胶层析等获得3个PPO单一同工酶PPOⅠ PPOⅡ、PPOⅢ,通... 详细信息

多酚氧化酶(PPO)多年来一直是国内外研究的热点,对茶叶品质的形成起关键作用,然而目前缺乏深入开展PPO单一同工酶的研究。本课题以龙井43号为材料,通过硫酸铵沉淀、离子交换层析、凝胶层析等获得3个PPO单一同工酶PPOⅠ PPOⅡ、PPOⅢ,通过MALDI串联飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-TOF质谱仪)对3个同工酶进行了初步鉴定。并对PPOⅡ酶性质进行了分析。主要研究结果如下： 1PPO同工酶的获取以缓冲液浸提、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose CL-6B离子交换层析、Sephadex G-150凝胶过滤层析等步骤可以有效地分离纯化茶树PPO同工酶。经以上各步分离纯化,共获得3个茶树PPO同工酶,分别为PPOⅠ、PPOⅡ、PPOⅢ,比活力分别为964.63、2325.39、2406.78U/mmg,分子量分别约为34kDa、53kDa、85kDa。 2茶树PPO同工酶质谱鉴定通过质谱鉴定PPOⅠ、PPOⅡ、PPOⅢ,经检索得到四种类似的物质：胞质核糖体蛋白、乳酰谷胱甘肽裂解酶、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基蛋白和蛋氨酸合成酶,前两个为PPO Ⅰ检测结果,后两个分别为PP0Ⅱ和PPOⅢ检测结果。 PPOⅠ检测得到两种类似物质：一种类似于茶树(Camellia sinensis)的胞质核糖体蛋白(cytoplasmic ribosomal protein),分子量为17267Da,pI10.26;另一种类似片段来源于水稻中的乳酰谷胱甘肽裂解酶(Lactoylglutathione lyase),分子量为32875Da, pI5.51. PPOⅡ类似于存在于茶科植物Franklinia alatamaha中的核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基蛋白(ribulose1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit protein),该物质分子量为53050Da, pI6.13。PPOⅡ可能与光合作用有关。 PPOIII类似于存在于茶树(Camellia sinensis)中分子量为85180Da, pI6.14的蛋氨酸合成酶(methionine synthase)。该物质可能与蛋氨酸和叶酸循环有关,调节生物体的生理过程。 3PPO同工酶酶学性质研究以邻苯二酚为底物,采用分光光度法对茶叶多酚氧化酶同工酶进行抑制剂、温度、pH、Cu2+浓度等酶学性质的研究。结果表明：同工酶PPOⅡ最适pH为6.0;PPOⅡ催化的酶促褐变反应符合米氏动力学方程,相应动力学参数Km=13.05mmol/L, Vmax=0.019OD460/min;抑制剂抗坏血酸、亚硫酸钠和L-半胱氨酸对PPOⅡ同工酶都有抑制作用,并且随着抑制剂浓度的增加残留酶活性降低;PPOⅡ的活性随着Cu2+浓度的增加先上升后下降,在Cu2+浓度为0.25х10-7mol/L时酶活性最高,当金属离子Cu2+浓度达到2х10-7mol/L时,PPOⅡ活性消失。

关键词：茶树多酚氧化酶同工酶纯化质谱鉴定酶学性质

人骨髓间质干细胞诱导成骨分化过程中差异表达蛋白的质谱鉴定及生物信息学分析

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安徽医科大学学报 2014年第12期49卷 1722-1726页

作者：张爱霞余伟华王涛嘉应学院生命科学学院梅州514015 中山大学中山医学院干细胞与组织工程中心广州510080

目的比较人骨髓间质干细胞(h MSCs)诱导成骨分化过程中的蛋白质组差异,寻找h MSCs成骨分化相关蛋白质。方法体外培养h MSCs并诱导成骨分化,收集h MSCs和成骨诱导分化3 d的细胞的全蛋白,应用双向凝胶电泳(2-DE)分离和图像分析软件进行蛋... 详细信息

目的比较人骨髓间质干细胞(h MSCs)诱导成骨分化过程中的蛋白质组差异,寻找h MSCs成骨分化相关蛋白质。方法体外培养h MSCs并诱导成骨分化,收集h MSCs和成骨诱导分化3 d的细胞的全蛋白,应用双向凝胶电泳(2-DE)分离和图像分析软件进行蛋白质点的识别和检测,通过比较蛋白质组学技术找出凝胶上差异2.0倍以上的蛋白质点,应用基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和生物信息学方法对差异蛋白点进行蛋白质的鉴定和分析。结果 h MSCs在体外成功诱导成骨分化,通过2-DE分离、MALDI-TOF-MS分析和生物信息学方法鉴定出了38种差异蛋白,其中22种蛋白质在成骨诱导3 d后表达明显上调,16种蛋白质在成骨诱导3 d后表达明显下调。利用Gene Ontology对所鉴定的蛋白质按分子功能和生物学途径进行分析显示,参与体内代谢、发育过程、催化反应和酶调节活性的蛋白质分别占29%、32%、44%、16%。结论蛋白质组学较好地显示了h MSCs诱导成骨分化过程中的蛋白质表达差异,这为进一步阐明h MSCs成骨分化的分子机制提供了新的思路。

关键词：骨髓间质干细胞蛋白质组学成骨分化质谱鉴定生物信息学

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用于质谱鉴定蛋白质胶内酶解方法的优化

南方农业学报 2011年第7期42卷 802-805页

作者：胡炜付强朱平川杨丽刘振方张明亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室南宁530005

【目的】提高蛋白质胶内酶解效率,减少萃取过程中肽段的损失,增加质谱鉴定的成功率。【方法】在常规胶内酶解方法的基础上,优化脱色、酶解、萃取等步骤,包括:用铁氰化钾和硫代硫酸钠对银染胶块脱色,酶解温度提高至55℃,以40mmol/L碳酸... 详细信息

【目的】提高蛋白质胶内酶解效率,减少萃取过程中肽段的损失,增加质谱鉴定的成功率。【方法】在常规胶内酶解方法的基础上,优化脱色、酶解、萃取等步骤,包括:用铁氰化钾和硫代硫酸钠对银染胶块脱色,酶解温度提高至55℃,以40mmol/L碳酸氢铵作为酶切缓冲液,使用50%乙腈(ACN)水溶液3步萃取;并使用一步法胶内酶解探索快速胶内酶解方法。【结果】使用铁氰化钾和硫代硫酸钠可在短时间内将银染胶块完全脱色,55℃温浴可使酶切时间由20h减少为2h,以40mmol/L碳酸氢铵作为酶切缓冲液,可省去ZipTip脱盐步骤。优化后,质谱鉴定率提高30.0%(绝对值),且能明显高酶切效率,使目标肽段更高丰度地呈现出来。【结论】优化后的胶内酶解法可显著提高蛋白质胶内酶解的质谱鉴定成功率和肽段覆盖率,其中一步法胶内酶解法有效减少了胶内酶解时间和步骤,可用于高丰度蛋白质的快速质谱检测。

关键词：胶内酶解质谱鉴定成功率肽段覆盖率

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稻瘟病菌分泌蛋白提取与质谱鉴定

稻瘟病菌分泌蛋白提取与质谱鉴定

高纯度白介素-3与假单胞菌外毒素融合蛋白的表达、纯化及质谱鉴定

中国化学会第二届全国质谱分析学术报告会

作者：康婕张文洋钟鸿英华中师范大学化学学院教育部农药与化学生物学重点实验室分子结构鉴定与精准生物医学分析质谱中心

稻瘟病菌是引发水稻病害的主要菌种,该致病菌属于半知菌亚门真菌,一般有灰梨孢或稻梨孢两种类型。它通过分泌黑色素、蛋白等物质感染水稻叶片、茎杆、穗部使水稻发生病变。稻瘟病菌的分泌蛋白经由稻瘟病菌核糖体合成,在菌体内膜系统加... 详细信息

稻瘟病菌是引发水稻病害的主要菌种,该致病菌属于半知菌亚门真菌,一般有灰梨孢或稻梨孢两种类型。它通过分泌黑色素、蛋白等物质感染水稻叶片、茎杆、穗部使水稻发生病变。稻瘟病菌的分泌蛋白经由稻瘟病菌核糖体合成,在菌体内膜系统加工修饰后分泌到体外,具有一定功能型作用。分泌蛋白在分泌到菌外前,在细胞内部进行了糖基化、羟基化、酰基化等一系列修饰,经过这些修饰分泌蛋白才能具有相应的生物功能。对稻瘟病菌分泌蛋白的研究可以帮助我们更好的了解稻瘟病菌的周期生活,有助于探索稻瘟病菌感染水稻的机制,从而遏制水稻病害的发生。分泌蛋白是低丰度蛋白,其提取沉淀物中干扰杂质过多,这给它的质谱鉴定带来了较大的困难。在本研究中,我们加大分泌蛋白提取量,实现了分泌蛋白的高通量测定,然后采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）对分泌蛋白进行纯化分离,从而降低了沉淀物中各种杂质的噪音干扰,得到的纯化蛋白使用基于基质辅助激光解吸电离时间飞行质谱仪（MALDI-TOF-MS）进行质谱分析,最后采用从头测序（de no vo sequencing）来找寻目标蛋白的多肽序列,克服了分泌蛋白低丰度难检验的难题,为我们探索稻瘟病菌感染水稻的机制提供了重要的线索

关键词：分泌蛋白稻瘟病菌聚丙烯酰胺质谱鉴定

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高纯度白介素-3与假单胞菌外毒素融合蛋白的表达、纯化及质谱鉴定

作者：廖乐乐重庆医科大学

学位级别：硕士

急性髓系白血病（Acute myelogenous leukemia,AML）是我国最常见的恶性血液系统肿瘤。目前已有大量研究表明,白血病干细胞（1eukemia stem cells,LSC）的病态克隆是产生和维持白血病的根本。LSC处于G0期,不仅具有自我更新的能力,还能... 详细信息

急性髓系白血病（Acute myelogenous leukemia,AML）是我国最常见的恶性血液系统肿瘤。目前已有大量研究表明,白血病干细胞（1eukemia stem cells,LSC）的病态克隆是产生和维持白血病的根本。LSC处于G0期,不仅具有自我更新的能力,还能增殖分化成各个时期的白血病细胞。LSC对常规化疗药物无效,是白血病复发的根源。所以寻找到一种方法能较为特异性的清除LSC是治愈白血病及清除残留病变的关键,随着生命科学的日新月异,在LSC靶向清除领域有了许多新的进展。白血病干细胞表面高表达CD123（IL-3R的α链）而正常造血干细胞（Hematopoietic stem cell,HSC）不表达,所以CD123是目前公认的可以从正常HSC中识别LSC的一个标记。本课题也从这个角度入手,尝试探讨CD123作为靶点的急性髓性白血病靶向治疗的新型治疗策略。目的:利用常见的表达纯化复性方法,获得大量高纯度、高活性的重组免疫毒素IL3-PE38KDEL并对其物理学及免疫学性质进行鉴定。方法:利用PQE30-IL3-PE38KDEL/SG12009原核表达系统生产重组免疫毒素IL3-PE38KDEL,在提取包涵体后,将溶解度经镍离子亲和层析柱层析及分子筛技术得到纯度较高的免疫毒素复性纯化产物,再经盐酸胍梯度复性,最后用westen-blot、质谱、氨基端测序等先进技术进行对目的产物鉴定。结果:发酵后目的蛋白表达量占总菌体的17.56%,经镍离子柱层析纯化复性后的目的蛋白纯度达到95%以上,westen-blot、质谱、氨基测序结果均表明,纯化产物分子量为54.9KD且具有相应的免疫学活性,序列与预期序列完全一致。结论:纯化复性方法对重组免疫毒素IL3-PE38KDEL的生物性质及纯度有较大影响选择一种适当的纯化复性方法至关重要。该实验为后续的重组免疫毒素IL3-PE38KDEL的功能研究奠定了基础。

关键词：重组免疫毒素 IL3-PE38KDEL 纯化复性质谱鉴定

甲基苯丙胺神经毒性相关硝化靶蛋白质的质谱鉴定

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甲基苯丙胺神经毒性相关硝化靶蛋白质的质谱鉴定

第十届全国药物依赖性学术会议暨首届中美药物滥用和HIV...

作者：王慧君李学锋邱平明谭晓辉南方医科大学基础医学院法医学系

＜正＞目的:近年来,甲基苯丙胺（methamphetamine,METH）成为危害最为严重的毒品之一。 METH 属于苯丙胺类兴奋剂,有较强的神经毒性。我们前期研究发现氧化应激参与 METH 神经毒性损伤作用,导致中毒动物模型脑组织中 NO 过表达。为了进... 详细信息

＜正＞目的:近年来,甲基苯丙胺（methamphetamine,METH）成为危害最为严重的毒品之一。 METH 属于苯丙胺类兴奋剂,有较强的神经毒性。我们前期研究发现氧化应激参与 METH 神经毒性损伤作用,导致中毒动物模型脑组织中 NO 过表达。为了进一步研究 METH 导致的氧化

关键词：甲基苯丙胺神经毒性硝化靶蛋白质质谱鉴定

来源： cnki会议评论

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柞蚕微孢子蛋白的质谱鉴定

柞蚕微孢子蛋白的质谱鉴定

华东六省一市生物化学与分子生物学学会2006年学术交流...

作者：王林玲陈克平姚勤李军刘晓秀陈慧卿江苏大学生命科学研究院

柞蚕微孢子是引起柞蚕微粒子病的病原。柞蚕微孢子纯化后经液氮研磨,用SDS和DDT的蛋白提取液抽提,凝胶电泳分离,考马斯亮兰染色后割取20条分离较好且条带清晰的蛋白条带做质谱鉴定。肽质量指纹图谱在NCBI效据库里搜索到9种蛋白,2种与孢... 详细信息

柞蚕微孢子是引起柞蚕微粒子病的病原。柞蚕微孢子纯化后经液氮研磨,用SDS和DDT的蛋白提取液抽提,凝胶电泳分离,考马斯亮兰染色后割取20条分离较好且条带清晰的蛋白条带做质谱鉴定。肽质量指纹图谱在NCBI效据库里搜索到9种蛋白,2种与孢子外膜有关的蛋白(表面糖蛋白和与阳离子流出相关的外膜输出蛋白),4种与核酸有关的蛋白,即假定的转录调控因子、LysR家族的转录调控因子、锌指蛋白和具有tRNA合成酶结构域的假定蛋白、2种氧化还原酶(双磷酸合成酶和假定的氧化还原酶)和热休克蛋白。这些蛋白都与微孢子的结构,生理状态和生理功能有关。

关键词：柞蚕微孢子蛋白质谱鉴定肽质量指纹图谱

来源： cnki会议评论

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串联质谱谱库搜索鉴定技术综述

计算机工程 2012年第7期38卷 269-272页

作者：王耀君孙世伟卜东波刘金刚首都师范大学计算机科学联合研究院北京100048 中国科学院计算技术研究所计算生物研究组北京100190

介绍蛋白质质谱鉴定领域的串联质谱谱库搜索技术,分析谱库搜索技术的基本原理,从多个角度阐述当前主流的谱库搜索方法,并对其优缺点进行比较,针对目前蛋白质质谱鉴定技术所存在的优缺点,设计其改进思路,论述目前谱库搜索技术所面临的问... 详细信息

介绍蛋白质质谱鉴定领域的串联质谱谱库搜索技术,分析谱库搜索技术的基本原理,从多个角度阐述当前主流的谱库搜索方法,并对其优缺点进行比较,针对目前蛋白质质谱鉴定技术所存在的优缺点,设计其改进思路,论述目前谱库搜索技术所面临的问题以及未来的研究趋势。

关键词：蛋白质鉴定串联质谱谱库搜索质谱鉴定