龙井43号多酚氧化酶同工酶质谱鉴定与酶性质研究

作     者：张书芹 

作者单位：华中农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：黄友谊

授予年度：2014年

学科分类：09[农学] 090203[农学-茶学] 0902[农学-园艺学] 

主      题：茶树多酚氧化酶 同工酶 纯化 质谱鉴定 酶学性质 

摘      要：多酚氧化酶(PPO)多年来一直是国内外研究的热点,对茶叶品质的形成起关键作用,然而目前缺乏深入开展PPO单一同工酶的研究。本课题以龙井43号为材料,通过硫酸铵沉淀、离子交换层析、凝胶层析等获得3个PPO单一同工酶PPOⅠ PPOⅡ、PPOⅢ,通过MALDI串联飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-TOF质谱仪)对3个同工酶进行了初步鉴定。并对PPOⅡ酶性质进行了分析。主要研究结果如下： 1PPO同工酶的获取 以缓冲液浸提、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose CL-6B离子交换层析、Sephadex G-150凝胶过滤层析等步骤可以有效地分离纯化茶树PPO同工酶。经以上各步分离纯化,共获得3个茶树PPO同工酶,分别为PPOⅠ、PPOⅡ、PPOⅢ,比活力分别为964.63、2325.39、2406.78U/mmg,分子量分别约为34kDa、53kDa、85kDa。 2茶树PPO同工酶质谱鉴定 通过质谱鉴定PPOⅠ、PPOⅡ、PPOⅢ,经检索得到四种类似的物质：胞质核糖体蛋白、乳酰谷胱甘肽裂解酶、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基蛋白和蛋氨酸合成酶,前两个为PPO Ⅰ检测结果,后两个分别为PP0Ⅱ和PPOⅢ检测结果。 PPOⅠ检测得到两种类似物质：一种类似于茶树(Camellia sinensis)的胞质核糖体蛋白(cytoplasmic ribosomal protein),分子量为17267Da,pI10.26;另一种类似片段来源于水稻中的乳酰谷胱甘肽裂解酶(Lactoylglutathione lyase),分子量为32875Da, pI5.51. PPOⅡ类似于存在于茶科植物Franklinia alatamaha中的核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基蛋白(ribulose1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit protein),该物质分子量为53050Da, pI6.13。PPOⅡ可能与光合作用有关。 PPOIII类似于存在于茶树(Camellia sinensis)中分子量为85180Da, pI6.14的蛋氨酸合成酶(methionine synthase)。该物质可能与蛋氨酸和叶酸循环有关,调节生物体的生理过程。 3PPO同工酶酶学性质研究 以邻苯二酚为底物,采用分光光度法对茶叶多酚氧化酶同工酶进行抑制剂、温度、pH、Cu2+浓度等酶学性质的研究。结果表明：同工酶PPOⅡ最适pH为6.0;PPOⅡ催化的酶促褐变反应符合米氏动力学方程,相应动力学参数Km=13.05mmol/L, Vmax=0.019OD460/min;抑制剂抗坏血酸、亚硫酸钠和L-半胱氨酸对PPOⅡ同工酶都有抑制作用,并且随着抑制剂浓度的增加残留酶活性降低;PPOⅡ的活性随着Cu2+浓度的增加先上升后下降,在Cu2+浓度为0.25х10-7mol/L时酶活性最高,当金属离子Cu2+浓度达到2х10-7mol/L时,PPOⅡ活性消失。