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多酚氧化酶PPO是一种金属蛋白酶,在茶叶加工制作过程中起着至关重要的作用,它可将茶叶中的多酚类物质酶促氧化成茶黄素、茶红素等关键品质成分物质,对红茶的品质产生重要影响。根据文献可知,多酚氧化酶主要与植物的抗逆性相关。但在茶树生长过程中,多酚氧化酶是否参与茶树抵抗外界胁迫、或在植物次生代谢途径上起到的作用,却并不明确。所以探究茶树中多酚氧化酶的生理功能有着重要的理论与实际意义。本论文筛选出3条茶树多酚氧化酶(CsPPOs)基因,并成功克隆它们全长;通过DNAMAN软件以及MEGA5.0软件对茶树3条基因进行生物信息学分析,结果表明,3条基因可能与茶树抗逆性相关;在预测网站上预测了3条基因在茶树体内的亚细胞定位情况,结果显示3条基因都定位在叶绿体中。利用qRT-PCR技术,分析了茶树多酚氧化酶基因在不同组织器官中的表达情况,以及诱导表达特异性,3条基因在不同组织器官中都有表达,CsPPO1在根中显著高表达,CsPPO3在幼嫩组织中表达较低,而在成熟组织中表达较高;在诱导特异性结果中,CsPPO1与CsPPO3可能参与茶树体内的抗病菌防御机制;CsPPO1和CsPPO2与茶树响应光诱导的关系更为密切;通过构建CsPPOs原核表达载体,将其转入蛋白表达菌株中,成功诱导CsPPOs蛋白表达,用纯酶进行酶反应,能与儿茶素反应,在380nm下检测到产物特征峰;最后通过过表达转基因烟草,发现在表型上,转基因烟草花较G28植物花色偏红,烟草体内的其他代谢产物也有不同程度的变化。本论文通过上述的研究,初步探究了多酚氧化酶在茶树体内的生理学意义,为茶树育种以及茶叶品质的提高提供了新的思路。

关键词：茶树多酚氧化酶组织特异性诱导特异性真核表达原核表达

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龙井43号多酚氧化酶同工酶质谱鉴定与酶性质研究

龙井43号多酚氧化酶同工酶质谱鉴定与酶性质研究

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作者：张书芹华中农业大学

学位级别：硕士

多酚氧化酶(PPO)多年来一直是国内外研究的热点,对茶叶品质的形成起关键作用,然而目前缺乏深入开展PPO单一同工酶的研究。本课题以龙井43号为材料,通过硫酸铵沉淀、离子交换层析、凝胶层析等获得3个PPO单一同工酶PPOⅠ PPOⅡ、PPOⅢ,通... 详细信息

多酚氧化酶(PPO)多年来一直是国内外研究的热点,对茶叶品质的形成起关键作用,然而目前缺乏深入开展PPO单一同工酶的研究。本课题以龙井43号为材料,通过硫酸铵沉淀、离子交换层析、凝胶层析等获得3个PPO单一同工酶PPOⅠ PPOⅡ、PPOⅢ,通过MALDI串联飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-TOF质谱仪)对3个同工酶进行了初步鉴定。并对PPOⅡ酶性质进行了分析。主要研究结果如下：1PPO同工酶的获取以缓冲液浸提、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose CL-6B离子交换层析、Sephadex G-150凝胶过滤层析等步骤可以有效地分离纯化茶树PPO同工酶。经以上各步分离纯化,共获得3个茶树PPO同工酶,分别为PPOⅠ、PPOⅡ、PPOⅢ,比活力分别为964.63、2325.39、2406.78U/mmg,分子量分别约为34kDa、53kDa、85kDa。2茶树PPO同工酶质谱鉴定通过质谱鉴定PPOⅠ、PPOⅡ、PPOⅢ,经检索得到四种类似的物质：胞质核糖体蛋白、乳酰谷胱甘肽裂解酶、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基蛋白和蛋氨酸合成酶,前两个为PPO Ⅰ检测结果,后两个分别为PP0Ⅱ和PPOⅢ检测结果。PPOⅠ检测得到两种类似物质：一种类似于茶树(Camellia sinensis)的胞质核糖体蛋白(cytoplasmic ribosomal protein),分子量为17267Da,pI10.26;另一种类似片段来源于水稻中的乳酰谷胱甘肽裂解酶(Lactoylglutathione lyase),分子量为32875Da, pI5.51.PPOⅡ类似于存在于茶科植物Franklinia alatamaha中的核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基蛋白(ribulose1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit protein),该物质分子量为53050Da, pI6.13。PPOⅡ可能与光合作用有关。PPOIII类似于存在于茶树(Camellia sinensis)中分子量为85180Da, pI6.14的蛋氨酸合成酶(methionine synthase)。该物质可能与蛋氨酸和叶酸循环有关,调节生物体的生理过程。3PPO同工酶酶学性质研究以邻苯二酚为底物,采用分光光度法对茶叶多酚氧化酶同工酶进行抑制剂、温度、pH、Cu2+浓度等酶学性质的研究。结果表明：同工酶PPOⅡ最适pH为6.0;PPOⅡ催化的酶促褐变反应符合米氏动力学方程,相应动力学参数Km=13.05mmol/L, Vmax=0.019OD460/min;抑制剂抗坏血酸、亚硫酸钠和L-半胱氨酸对PPOⅡ同工酶都有抑制作用,并且随着抑制剂浓度的增加残留酶活性降低;PPOⅡ的活性随着Cu2+浓度的增加先上升后下降,在Cu2+浓度为0.25х10-7mol/L时酶活性最高,当金属离子Cu2+浓度达到2х10-7mol/L时,PPOⅡ活性消失。

关键词：茶树多酚氧化酶同工酶纯化质谱鉴定酶学性质

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