检索结果-南通市图书馆

基于转录组测序解析草地贪夜蛾对溴氰虫酰胺的解毒代谢分子机制

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

植物保护学报 2023年第3期50卷 800-811页

作者：杨媛雪王爱玉张芸张开军薛超刘怀赵鸣张建华山东省农业科学院经济作物研究所济南250100 西南大学植物保护学院重庆400715

为阐明草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda对溴氰虫酰胺的解毒代谢分子机制,通过LC50的溴氰虫酰胺诱导草地贪夜蛾3龄幼虫后,利用酶活测定和转录组测序鉴定解毒代谢相关基因,并采用实时荧光定量PCR技术对细胞色素P450单加氧酶(cytochrome P... 详细信息

为阐明草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda对溴氰虫酰胺的解毒代谢分子机制,通过LC50的溴氰虫酰胺诱导草地贪夜蛾3龄幼虫后,利用酶活测定和转录组测序鉴定解毒代谢相关基因,并采用实时荧光定量PCR技术对细胞色素P450单加氧酶(cytochrome P450 monooxygenase,P450)基因进行验证分析。结果表明,经LC50的溴氰虫酰胺处理后,草地贪夜蛾3龄幼虫体内3种解毒代谢酶活性较对照均有所升高,但仅P450活性较对照显著升高,而谷胱甘肽S-转移酶和羧酸酯酶与对照无显著差异。经LC50的溴氰虫酰胺处理后草地贪夜蛾3龄幼虫转录组中共筛选到1408个差异表达基因,其中上调表达的基因有935个,下调表达的基因有473个。药物代谢-细胞色素P450通路、药物代谢-其他酶通路及细胞色素P450对异生物质的代谢通路中有超过20个基因存在差异表达。在草地贪夜蛾转录组中筛选鉴定到121个P450基因,其中,属于CYP2、CYP3、CYP4以及Mito家簇的基因分别有9、45、58和9个,而经LC50的溴氰虫酰胺诱导后有8个P450基因上调表达,实时荧光定量PCR验证结果显示其中有6个P450基因CYP321A8、CYP6B2、CYP6B7、CYP6B5、CYP4C1及CYP4D1表达量显著上调,这些都属于与害虫抗药性相关的CYP3和CYP4家簇基因。表明P450基因CYP321A8、CYP6B2、CYP6B7、CYP6B5、CYP4C1及CYP4D1可能在草地贪夜蛾对溴氰虫酰胺的解毒代谢中发挥着重要作用。

关键词：草地贪夜蛾溴氰虫酰胺转录组解毒代谢细胞色素P450单加氧酶

氨氮胁迫对青蛤解毒代谢影响及相关基因的功能研究

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

氨氮胁迫对青蛤解毒代谢影响及相关基因的功能研究

作者：梁夏菲江苏海洋大学

学位级别：硕士

氨氮是养殖水环境中常见的胁迫因子,其可影响水生动物生长发育、生理代谢和行为反应,甚至可能直接造成水生动物大规模死亡。已有研究表明,部分淡水鱼类、甲壳动物和现存气呼吸型海水鱼等可通过调节解毒代谢途径、改变排泄行为等以降低... 详细信息

氨氮是养殖水环境中常见的胁迫因子,其可影响水生动物生长发育、生理代谢和行为反应,甚至可能直接造成水生动物大规模死亡。已有研究表明,部分淡水鱼类、甲壳动物和现存气呼吸型海水鱼等可通过调节解毒代谢途径、改变排泄行为等以降低氨氮毒害。然而,滩涂贝类如何降低氨氮毒害及其耐氨氮适应机制鲜有研究。青蛤(Cyclina sinensis)是我国重要的滩涂贝类,具有较强的耐氨氮适应能力,然而其耐氨氮适应机制缺乏深入研究。因此,本文以青蛤为研究对象,采用生态毒理学方法查明氨氮对青蛤的半致死浓度和安全浓度;在此基础上,从生理生化水平、分子水平和组织水平探究氨氮胁迫对青蛤的毒性作用机理和解毒代谢机制,以期解析青蛤耐氨氮适应机制。本研究可以为贝类养殖过程中水质调控和青蛤耐氨氮新品种选育提供理论指导。结果如下:1、急性氨氮胁迫对青蛤抗氧化和解毒代谢影响研究本研究首先评估了青蛤96 h氨氮半数致死浓度(LC-96 h)和安全浓度(SC),研究结果表明,氨氮对青蛤的LC-96h和SC分别为66.79 mg/L和6.58 mg/L,其中,分子氨(NH)的LC-96 h和SC分别为1.70 mg/L和0.17 mg/L。并在此基础上研究了不同氨氮浓度胁迫下青蛤肝胰腺的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷氨酰胺合成酶(GS)活性、谷氨酰胺(Gln)和尿素影响,研究结果表明SOD和CAT活性均随TAN浓度呈剂量和时间依赖性。GS活性、Gln含量和尿素含量均显著升高。以上研究结果表明,氨氮胁迫下,青蛤增强肝胰腺抗氧化能力以及将氨转化为Gln和尿素的联合作用,可降低氨氮对青蛤的毒害。2、青蛤解毒代谢关键基因的克隆、序列特征及表达分析本研究筛选了青蛤解毒代谢途径关键基因谷胱甘肽硫转移酶基因(Cs GST)和氨转运蛋白基因(Cs Rhbg)进行克隆和功能分析。研究结果表明,Cs GST的全长序列共1141个碱基,开放阅读框有609个碱基,编码202个氨基酸。序列比对表明其属于细胞质sigma类GST。该蛋白包括两个保守的结构域:保守结构域GST＿N含有GSH结合位点(G位点);保守结构域GST＿C含有底物结合口袋位点(H位点)。系统进化树结果表明与硬壳蛤同源性高达76.35%。组织表达研究表明,Cs GST在青蛤的组织中均有表达。Cs Rhbg长一共1777个碱基,其中5′非编码区有355个碱基,ORF区有1422个碱基,共编码473个氨基酸。该蛋白含有1个典型的保守结构域:氨转运蛋白家族结构域。系统进化树结果表明与硬壳蛤同源性高达91.33%。组织表达研究表明,Cs Rhbg在青蛤组织中均有表达。3、慢性氨氮胁迫对青蛤转运途径的影响研究为探讨慢性氨氮胁迫对青蛤转运途径的影响,研究了氨氮胁迫对鳃和肝胰腺中Cs Rhbg m RNA表达、GS活性、谷氨酸脱氢酶(GDH)活性以及鳃组织结构影响。结果表明:实验组鳃的GS活力在12 h内显著升高(P解毒代谢水平的评价指标。4、慢性氨氮胁迫对青蛤代谢途径的影响研究为探讨慢性氨氮胁迫对青蛤代谢途径的影响,研究了氨氮胁迫对鳃和肝胰腺的Cs GST m RNA表达、GST活性、尿素氮(BUN)含量浓度以及肝胰腺结构影响。结果表明:实验组鳃BUN含量在96 h达到最大值,随后呈下降趋势;实验组鳃GST呈波动变化趋势,在24 h达到最大值,随后呈下降趋势,在192 h后仍显著高于对照组水平(P<0.05);实验组鳃Cs GST m RNA表达在24 h达到最大值,随后呈下降趋势,但在768 h又上升,且高于对照组水平(P<0.05)。实验组肝胰腺BUN含量在192 h达到最大值后,呈下降趋势;实验组肝胰腺GST在24 h达到最大值后,呈下降趋势;实验组肝胰腺Cs GST m RNA表达量在24 h达到最大值后,呈下降趋势。在氨氮胁迫768 h下,青蛤肝胰腺腺管肿大、管腔缩小、血细胞浸润、脂褐素聚集、消化细胞萎缩和上皮细胞脱落,随着胁迫时间的延长,青蛤肝胰

关键词：青蛤氨氮胁迫解毒代谢氨氮代谢氨氮转运

柘蚕沙与柘木化学成分、家蚕肠道芽孢杆菌解毒代谢的研究

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

柘蚕沙与柘木化学成分、家蚕肠道芽孢杆菌解毒代谢的研究

作者：元双芝山东大学

学位级别：硕士

天然的异戊烯化黄酮类化合物,其结构多样,生物活性显著,在多科药用植物中均有分布,具有较高的研究价值;而异戊烯化黄酮苷类成分是一类以异戊烯基取代的黄酮类化合物为苷元的糖苷化产物。尽管已经分离得到大量的异戊烯化黄酮类化合物或... 详细信息

天然的异戊烯化黄酮类化合物,其结构多样,生物活性显著,在多科药用植物中均有分布,具有较高的研究价值;而异戊烯化黄酮苷类成分是一类以异戊烯基取代的黄酮类化合物为苷元的糖苷化产物。尽管已经分离得到大量的异戊烯化黄酮类化合物或黄酮苷类成分,但天然存在的异戊烯化黄酮苷类成分发现较少,主要从植物中分离获得或通过微生物转化得到;此外,异戊烯化的黄酮化合物被糖苷化后,原苷元的化学性质和生物学活性发生改变;因此,异戊烯化黄酮类化合物及其苷类成分的化学结构和生物学活性研究具有重要意义。本文第二章,通过常规柱层析和高效液相色谱法(HPLC)对柘蚕沙中化学成分进行系统分离纯化,并利用核磁波谱(NMR spectra)以及其他手段(紫外UV、红外IR、比旋光度Specific Rotation、电子圆二色谱ECD和高分辨质谱HRESIMS)共鉴定了 35个化合物,包括23个异戊烯化异黄酮葡萄糖苷,其中含21个新化合物,Silexcrin A-U(1-21);10个异戊烯化异黄酮和2个黄酮醇葡萄糖苷。从柘蚕沙中分离得到的异戊烯化异黄酮葡萄糖苷主要在7、3’或4’位羟基上连接上1～2个葡萄糖。通过计算ECD鉴定了两对差向异构体,Silexcrin M-N(13-14)、Silexcrin O-P(15-16)。两对差向异构体的苷元部分均为含有一个手性中心的对映异构体,而当在C环的3’-OH处引入一个葡萄糖时,它们就变成了两对差向异构体,化学性质随之发生改变,这说明糖基化也是实现对映体分离的一种有效方式。此外,因自然界中天然存在的异戊烯化异黄酮苷类成分较少,因此,以柘叶为食的家蚕所产生的粪便排泄物——柘蚕沙,是获得异戊烯化异黄酮苷的天然来源。本文第三章中,我们通过液相HPLC分析结果,发现柘蚕沙与柘叶成分的主要差异是异戊烯化的异黄酮苷。我们以蚕沙中主成分Silexcrin A-E(1-5)和对应苷元6,8-diprenylorobol(24)进行后续研究。利用LC-MS定量分析,进一步证明异戊烯化异黄酮苷并不存在于柘叶中,而是由家蚕肠道代谢产生。据文献报道,芽孢杆菌为家蚕肠内一类具有糖基转移酶(GTs)的肠道优势益生菌,能够实现化合物的糖苷化。我们利用3种芽孢杆菌属细菌对异戊烯化异黄酮,6,8-diprenylorobol(24)进行体外微生物转化,验证了芽孢杆菌属细菌能够将其转化生成相应的糖苷化产物Silexcrin A-E(1-5)。通过大蜡螟的毒性试验,证明了来自柘叶的6,8-diprenylorobol(24)对大蜡螟幼虫具有毒性影响,而其糖苷化产物Silexcrin B(2)的毒性减弱。经MTT法和细胞流式术,我们还发现6,8-diprenylorobol(24)对人脐静脉上皮细胞(HUVEC)也有强的毒性作用,IC50值为1.96μM,能够诱导HUVEC细胞凋亡,阻滞细胞停留在G1期,阻断细胞内DNA的合成以及减少细胞内ROS生成;而其异戊烯化异黄酮苷对HUVEC细胞的毒性大大减弱。揭示了糖苷化是一种重要的解毒方式。此外,我们利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)作为益生菌进行家蚕的益生菌试验。添加B.subtilis后,家蚕体重增加,尤以野三元品系家蚕体重呈显著性增加;依据16S rDNA肠道菌测序分析,家蚕肠道菌群组成发生改变,芽孢杆菌的相对丰度增加;通过HPLC对参与试验家蚕新鲜蚕沙中Silexcrin A-E(1-5)和对应苷元6,8-diprenylorobol(24)相对含量的变化分析,发现添加B.subtilis野三元家蚕的柘蚕沙中5种异戊烯化异黄酮苷总相对含量呈显著性上升,而其苷元6,8-diprenylorobol(24)相对含量显著性下降。由此表明,B.subtilis作为益生菌可以家蚕肠道定植,改善家蚕肠道微环境,改变肠道微生物菌群组成,并促进家蚕生长发育;此外,通过对柘叶中异戊烯化异黄酮类成分的糖苷化,降低毒性成分的含量,增加无毒或减毒的异戊烯化异黄酮苷的含量,通过糖苷化以发挥肠道解毒作用。我们发现肠道芽孢杆菌在家蚕的生长发育中发挥重要作用,为解决家蚕取食柘叶适应性差以及促进生长发育等方面提供思路和依据,为进一步开发蚕用益生菌制剂提供优良策略。此外,在第四章中,我们还对同植物柘树的根,其极性较大的正丁醇萃取部位进行化学成分的研究,从该部分共分离得到18个化合物,包括17个黄酮类化合物和1个Pyroglutamic acid的衍生物;其中,化合物36为黄烷醇类;化合物37-39,为苄基取代的二氢黄酮醇类化合物。

关键词：柘蚕沙异戊烯化异黄酮苷异戊烯化异黄酮芽孢杆菌糖苷化解毒代谢柘木

二化螟谷胱甘肽S-转移酶的鉴定分析及其在阿维菌素解毒代谢中的作用研究

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

二化螟谷胱甘肽S-转移酶的鉴定分析及其在阿维菌素解毒代谢中的作...

作者：吴赵露扬州大学

学位级别：硕士

二化螟（Chilo suppressalis）是水稻上一种主要的常发性害虫,危害严重时可造成水稻作物严重减产。大环内酯类杀虫剂阿维菌素对昆虫和螨虫具有良好的杀虫活性。有研究发现,二化螟对阿维菌素的抗性水平与试虫中的谷胱甘肽S-转移酶（gluta... 详细信息

二化螟（Chilo suppressalis）是水稻上一种主要的常发性害虫,危害严重时可造成水稻作物严重减产。大环内酯类杀虫剂阿维菌素对昆虫和螨虫具有良好的杀虫活性。有研究发现,二化螟对阿维菌素的抗性水平与试虫中的谷胱甘肽S-转移酶（glutathioneS-transferases,GSTs）活性呈正相关,GSTs可能是导致二化螟对阿维菌素产生抗药性的部分原因。GSTs是生物体中一种主要的解毒酶,能够催化谷胱甘肽和亲电底物结合,增加有毒物质的水溶性,并且能够消除生物体内因受到氧化应激胁迫而产生的活性氧（reactive oxygen species,ROS）,从而减少或避免内源性和外源性有毒物质对生物体造成损害。GSTs也是昆虫Ⅱ相解毒代谢反应的主要代谢酶之一,在昆虫对杀虫剂的解毒代谢及昆虫抗药性的产生中发挥重要作用。本文研究中,基于二化螟转录组和基因组信息,在二化螟中共鉴定到23个CsGSTs基因,包括21个胞质型CsGSTs和2个微粒体型CsGSTs。其中,21个胞质型CsGSTs又可以细分到7个亚家族中,包含3个Delta亚家族基因,5个Epsilon亚家族基因,4个Omega亚家族基因,4个Sigma亚家族基因,1个Theta亚家族基因,2个Zeta亚家族基因和2个Unclassified亚家族基因。对21个胞质型CsGSTs的多重序列比对分析显示,同一亚家族的CsGSTs序列具有较高序列相似性,而不同亚家族的CsGSTs序列同源性则相对较低。大多数胞质型CsGSTs都具有重要的GSH结合位点（G位点）和底物结合位点（H位点）,而在CsGSTe5中没有预测到G位点和H位点,在CsGSTe1、CsGSTe3、CsGSTe4、CsGSTo1-4和CsGSTz1-2中没有发现G位点。此外,Delta类CsGSTs（CsGSTd1-3）具有相同的GSH结合位点,但具有不同的底物结合位点。Sigma类CsGSTs（CsGSTs1-4）具有保守的GSH结合位点,而CsGSTs1与CsGSTs2-4则具有不同的底物结合位点。系统发育分析表明,二化螟CsGSTs与鳞翅目昆虫GSTs具有较高的同源性,不同昆虫的同源基因共聚同一进化枝。对二化螟CsGSTs的基因组结构分析发现,大部分CsGSTs基因包含4-7个外显子。利用RT-qPCR测定了 CsGSTs在二化螟解毒代谢相关组织中的表达量,发现CsGSTs1在幼虫中肠中的表达水平最高,在脂肪体中同样具有很高的表达水平;CsGSTe3和CsGSTo4主要在中肠中表达,CsGSTd2-3和CsGSTs2-3在两种组织中均高表达,而CsGSTe2、CsGSTe4和CsGSTe5在两种组织中的表达量均非常低。杀虫剂增效实验表明,使用马来酸二乙酯（diethylmaleate,DEM）处理二化螟试虫后,二化螟对阿维菌素的敏感性显著增加。使用低剂量0.05 mg/L阿维菌素处理二化螟后,相比于对照组中,CsGSTs酶活性在药剂处理6h后显著提高,在处理12和24 h后没有发生显著变化。此外,测定了 0.05 mg/L阿维菌素处理二化螟6h和24h后CsGSTs基因的表达变化。结果显示,只有CsGSTt1基因在阿维菌素处理6 h后的整虫中上调表达。而在阿维菌素处理24 h后,有16个CsGSTs基因在二化螟整虫中上调表达,其中4个CsGSTs基因（CsGSTe2、CsGSTe4、CsGSTo4和CsGSTu1）在处理试虫的中肠和脂肪体组织中被显著诱导表达。这些结果表明,CsGSTs参与了二化螟对阿维菌素的解毒代谢。为了进一步研究CsGSTs在二化螟对阿维菌素解毒代谢中的作用,本文开展了 CsGSTs的体外表达研究,通过使用大肠杆菌原核表达系统,成功对CsGSTd1、CsGSTe2、CsGSTe4、CsGSTo2、CsGSTs1、CsGSTs3 和 CsGSTu1 共 7 个 CsGSTs蛋白进行重组表达。使用Western Blot对表达的CsGSTs蛋白进行检测,7个重组蛋白的分子量大小均在30 kDa左右。通过对体外表达的7个CsGSTs进行纯化,进一步对它们的酶动力学性质进行测定,结果显示CsGSTs重组蛋白的米氏常数Km 范围在 0.38±0.21-3.01±1.58 mM 之间,Vmax 在 0.10±0.00-0.81±0.52μmol/min/mg之间。对CsGSTs酶活性的抑制实验结果显示,GSTs抑制剂S-己基谷胱甘肽（S-Hexylglutathione,GTx）对CsGSTs重组蛋白具有不同程度的抑制作用,其中GTx对CsGSTs1重组蛋白酶活性的抑制效果最好,抑制中浓度IC50为 0.094 mM,对 CsGSTd1、CsGSTde2、CsGSTe4、CsGSTo2、CsGSTs3 和 CsGSTu1的抑制中浓度介于1.645-4.853 mM。阿维菌素对重组蛋白CsG

关键词：二化螟谷胱甘肽S-转移酶阿维菌素解毒代谢体外表达

栉孔扇贝在二噁英胁迫下解毒代谢过程与生物标志物的研究

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

海洋湖沼通报 2019年第6期 68-77页

作者：赵亚楠潘鲁青中国海洋大学海水养殖教育部重点实验室山东青岛266003

本研究将栉孔扇贝(Chlamys farreri)分别暴露于0、0.001、0.01和0.1μg/L的2,3,7,8-四氯二苯并-对-二噁英(TCDD)中,分别于0、1、3、6、10、15d取消化盲囊样品,初步探究了栉孔扇贝在TCDD胁迫下的解毒代谢过程。结果表明:TCDD对栉孔扇贝Ah... 详细信息

本研究将栉孔扇贝(Chlamys farreri)分别暴露于0、0.001、0.01和0.1μg/L的2,3,7,8-四氯二苯并-对-二噁英(TCDD)中,分别于0、1、3、6、10、15d取消化盲囊样品,初步探究了栉孔扇贝在TCDD胁迫下的解毒代谢过程。结果表明:TCDD对栉孔扇贝AhR信号通路和解毒代谢关键基因表达均具有显著影响,而对照组无明显变化。各染毒组AhR信号通路和I相、II相、III相代谢关键基因表达在15d内呈峰值变化,于10d达到最大值,其中HSP90、XAP2和ABCB1基因表达量呈现明显剂量效应,GST-microsomal、SULT1B1、UGT和ABCC1、ABCG2基因表达量均为:中浓度组>高浓度组>低浓度组,而且AhR、ABCC1、ABCG2基因表达分别与ARNT、GST-microsomal、UGT和SULT1B1基因表达变化趋势类似。IBR分析表明,解毒代谢关键基因表达在不同时间对TCDD染毒浓度表现出不同的响应水平,ARNT、ABCG2基因表达在各个染毒时间点均具有较高响应程度。由此可见,栉孔扇贝在TCDD胁迫下由AhR信号介导,通过I相、II相、III相连续的代谢完成对TCDD的解毒代谢过程,ARNT、ABCG2基因表达可作为栉孔扇贝在TCDD胁迫下的生物标志物。

关键词：栉孔扇贝 2,3,7,8-四氯二苯并-对-二噁英解毒代谢综合生物标志物

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

昆虫共生菌与宿主的解毒代谢关系研究进展

农药学学报 2019年第5期21卷 729-735页

作者：张云骅李建洪万虎华中农业大学植物科学技术学院昆虫资源利用与害虫可持续治理湖北省重点实验室

昆虫共生菌参与宿主的各种生理活动,已被作为昆虫的“多功能器官”靶向进行研究,近期研究表明昆虫共生菌与宿主的解毒代谢功能相关。本文聚焦昆虫共生菌对宿主解毒代谢的积极补偿作用,综述了昆虫共生菌在昆虫营养代谢和解毒代谢中的功能... 详细信息

昆虫共生菌参与宿主的各种生理活动,已被作为昆虫的“多功能器官”靶向进行研究,近期研究表明昆虫共生菌与宿主的解毒代谢功能相关。本文聚焦昆虫共生菌对宿主解毒代谢的积极补偿作用,综述了昆虫共生菌在昆虫营养代谢和解毒代谢中的功能,昆虫共生菌直接对有毒物质进行代谢或间接介导宿主的解毒酶或相关基因的表达,进而影响昆虫的解毒代谢功能,提升昆虫宿主在逆境压力与农药胁迫中的适应力与竞争力。对今后关于共生菌与宿主解毒代谢研究的方向进行了展望。

关键词：昆虫共生菌宿主解毒代谢解毒酶间接调控研究进展

ABC转运蛋白在二化螟对氯虫苯甲酰胺和阿维菌素解毒代谢中的作用研究

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

ABC转运蛋白在二化螟对氯虫苯甲酰胺和阿维菌素解毒代谢中的作用...

作者：杨雪梅扬州大学

学位级别：硕士

二化螟（Chilo suppressalis）是水稻作物上最主要的害虫之一。由于化学农药的不合理使用,导致二化螟对杀虫剂的抗药性迅速发展,进一步加大了防治难度。ABC转运蛋白（ATP-binding cassette transporter）是生物中最大的跨膜蛋白家族之一... 详细信息

二化螟（Chilo suppressalis）是水稻作物上最主要的害虫之一。由于化学农药的不合理使用,导致二化螟对杀虫剂的抗药性迅速发展,进一步加大了防治难度。ABC转运蛋白（ATP-binding cassette transporter）是生物中最大的跨膜蛋白家族之一,广泛存在于古生菌、真细菌及真核生物中,能够对细胞中多种物质如脂类、氨基酸、多肽类、代谢产物、金属离子、毒素和化学治疗药物等进行跨膜转运。ABC转运蛋白参与对药物的吸收与排泄,而不经过其他酶的修饰,因此在药物代谢动力学机制上起重要作用。本研究利用RNA-Seq技术,对LC30亚致死剂量氯虫苯甲酰胺处理的二化螟幼虫进行比较转录组分析,探索氯虫苯甲酰胺对二化螟幼虫基因表达的影响。研究结果共鉴定出908个差异表达基因（DEGs）,其中441个基因表达上调,467个个基因表达下调。基因富集分析表明,下调的DEGs主要与糖类、能量、脂肪和氨基酸代谢及翻译后修饰有关,参与信号转导的大部分DEGs则上调表达。通过数据库检索,进一步将差异表达基因（DEGs）分类并富集在不同的功能类别和通路中,利用RT-qPCR对参与防御和解毒代谢的DEGs的表达变化进行验证。研究结果为理解二化螟的解毒代谢分子机制奠定基础。从二化螟基因组和转录组中共鉴定到54个ABC转运蛋白,通过Blast比对与系统发育分析,将ABC转运蛋白分为八个亚家族（ABCA-ABCH）,包括6个ABCA亚家族基因,10个ABCB亚家族基因,12个ABCC亚家族基因,2个ABCD亚家族基因,1个ABCE亚家族基因,3个ABCF亚家族基因,16个ABCG亚家族基因和4个ABCH亚家族基因。ABC转运蛋白基因序列的开放阅读框大小范围为1674bp（CsABCA13）到9273 bp（CsABCB1B）之间,编码558～3091个氨基酸,分子量大小在 60.96 kDa（CsABCA13）到341.55 kDa（CsABCB1B）之间,等电点介于5.55～9.26之间。系统发育分析表明,二化螟CsABCH与CsABCA和CsABCG家族的同源性最近,CsABCC与CsABCE和CsABCD具有较高的同源性,CsABCB与CsABCC具有很高的同源性。相同亚家族的基因聚为一支,且每个亚家族都有明显的功能聚类。杀虫剂增效作用实验表明,使用ABC转运蛋白抑制剂维拉帕米处理后可显著增加氯虫苯甲酰胺和阿维菌素对二化螟的毒力作用。结合转录组分析结果,对氯虫苯甲酰胺处理24小时后引起表达量变化的21个ABC基因进行验证,其中6个ABC转运蛋白基因显著上调,包括CsABCC8、CsABCG1C和CsABCH1等。经阿维菌素处理24小时后有6个ABC转运蛋白基因显著上调,包括CsABCA4、CsABCE1、CsABCF1、CsABCF2、CsABCC8和CsABCH1。同时测定了氯虫苯甲酰胺和阿维菌素处理后,ABC转运蛋白基因在解毒相关组织中的表达变化。利用RT-qPCR检测CsABCC8,CsACG1C和CsABCH1在二化螟不同发育阶段和不同组织的表达量,CsABCC8表达量明显高于CsABCG1C和CsABCH1在不同龄期的表达量,CsABCG1C和CsABCH1在幼虫阶段的表达量均较低。组织表达分析结果显示,CsABCC8基因在二化螟不同组织中的表达量均较高,在脑中的表达量最高。CsABCG1C和CsABCH1基因在二化螟神经索、脑和卵巢中均有较高表达,且CsABCG1C基因在二化螟表皮中也有较高的表达。为进一步验证二化螟ABC转运蛋白对杀虫剂的转运功能,我们对前期发现过表达的CsABCC8,CsABCG1C和CsABCH1等5个ABC基因的开放阅读框进行克隆并体外表达。通过构建稳定表达的pFastBACHTA真核表达体系,将二化螟CsABC和对照绿色荧光蛋白EGFP在昆虫Sf9细胞中重组表达。利用免疫荧光技术,检测到重组蛋白在细胞中成功表达。使用CCK8方法对表达不同重组蛋白的细胞毒性进行测定,在不使用杀虫剂处理下,表达CsABCC8、CsABCH1和CsABCE1的细胞活性显著高于表达EGFP的细胞活性。在使用杀虫剂处理下,相比于表达EGFP的细胞活性,表达CsABCC8、CsABCH1和CsABCE1蛋白的细胞活性进一步显著增加,表达的ABC蛋白增加了细胞对杀虫剂的外排作用从而显著降低杀虫剂对Sf9细胞的毒性。其中,相比于表达EGFP的细胞,表达CsABCC8和CsABCH1的细胞对氯虫本甲酰胺、溴氰虫酰胺、阿维菌素、氟虫腈和毒死蜱的细胞活性显著增加,表达CsABCE1的细胞对氯虫本甲酰胺、溴氰虫酰胺、阿维菌素、溴氰菊酯和茚虫威的细胞活性显著增加,说明二化螟CsABCC8、CsABCH1和CsABCCE1参与了对杀虫剂的转运代谢。本文研究结果为二化螟ABC蛋白转运代谢杀虫剂提供直接证据,进一步丰富了昆虫对杀虫剂的抗药性机制

关键词：二化螟 ABC转运蛋白转录组基因表达解毒代谢

棉铃虫Clan 2和线粒体Clan中细胞色素P450基因的解毒代谢功能研究

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

棉铃虫Clan 2和线粒体Clan中细胞色素P450基因的解毒代谢功能研究

作者：屈琼南京农业大学

学位级别：硕士

细胞色素P450是一类在生物体内广泛分布的氧化酶。P450通过催化单个氧原子插入底物,增加底物的亲水性从而促进下游的水解、结合、糖基化等反应。在昆虫体内,P450作为重要的解毒酶系,参与昆虫对植物次生物质和杀虫剂的化学防御过程,对昆... 详细信息

细胞色素P450是一类在生物体内广泛分布的氧化酶。P450通过催化单个氧原子插入底物,增加底物的亲水性从而促进下游的水解、结合、糖基化等反应。在昆虫体内,P450作为重要的解毒酶系,参与昆虫对植物次生物质和杀虫剂的化学防御过程,对昆虫寄主选择以及杀虫剂抗性的演化具有重要的贡献。昆虫P450主要分为4个集团(clan),但一直以来,功能研究主要集中在广泛扩增且被认为与化学防御相关的Clan 3和Clan 4中,而进化保守的Clan 2和线粒体Clan(Clan M)中的P450功能研究较少,一般认为其与昆虫的生理过程相关,主要参与昆虫的内源性激素、信号化合物的合成或代谢。然而,之前少量的研究也发现Clan 2和Clan M中P450基因的转录水平可以被多个外源化合物诱导上调,且Clan M中个别P450可以代谢杀虫剂,预示这两个集团中的P450具有潜在的外源化合物解毒能力。本研究针对典型的多食性害虫-棉铃虫体内的全部8个Clan 2和10个Clan M P450基因,通过基因克隆、体外功能验证以及外源化合物诱导三个方面,筛选了两个集团中P450在植物次生物质和杀虫剂解毒中的作用和潜力,研究结果为棉铃虫化学防御、害虫抗药性分子机理的研究提供了重要信息和新的视角。具体结果如下:1.棉铃虫Clan 2和Clan M细胞色素P450基因的体外表达及体外代谢体系构建基因组数据显示,棉铃虫体内有8个Clan 2和10个Clan M P450且其中多个成员的转录水平可以被外源化合物诱导上调或在杀虫剂抗性品系体内组成型上调,具有解毒代谢外源化合物的潜力。为了证实其功能,本研究对这18个P450基因进行了克隆,之后利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac)在Sf9细胞中对克隆的P450进行了体外表达,其中Clan 2 P450与棉铃虫细胞色素P450还原酶(CPR)进行共表达,Clan M P450与棉铃虫铁氧还蛋白(Adx)以及铁氧还蛋白还原酶(Ad R)进行共表达。还原型CO差光谱检测结果显示,除了Clan M中的CYP49A1和CYP428A1之外,其余16个P450均成功在体外进行了表达。模式底物代谢检测结果显示,体外重组的Clan 2和Clan M P450中均有成员表现出氧脱烷基或苄基的能力,说明线粒体和微粒体P450电子传递体系在体外均可正常运行。本研究在体外成规模表达了棉铃虫所有Clan 2和Clan M P450,并成功构建线粒体P450体外电子传递体系,为棉铃虫两个集团P450对外源化合物的体外代谢功能验证奠定了重要基础。2.棉铃虫Clan 2和Clan M细胞色素P450对外源化合物的体外代谢之前的研究发现,以氰戊菊酯为代表的杀虫剂和2-十三烷酮为代表的植物次生性化合物可以诱导棉铃虫Clan 2和Clan M中多个P450基因表达量的上调,但目前还没有证据证明两个集团的P450直接参与这些化合物的解毒代谢。所以本研究利用重组P450,在体外检测了对艾氏剂、顺式氰戊菊酯、2-十三烷酮和花椒毒素的代谢能力。体外代谢结果显示,棉铃虫Clan 2中的CYP305B1和CYP18A1以及线粒体P450CYP333B3具有环氧化艾氏剂的能力,Clan2中的CYP305B1和CYP339A1能代谢顺式氰戊菊酯,Clan M中的CYP303A1可以高效代谢2-十三烷酮,所有P450均不能代谢花椒毒素。此外还发现,线粒体P450与Adx/Ad R的共表达比例会影响重组P450的表达量和代谢活性,MOI比例为1:1:1时,P450蛋白表达量和代谢活性达到较合适的平衡。本研究为昆虫化学防御以及昆虫-寄主共同进化的分子机制研究提供重要线索,同时为杀虫剂抗性机理的研究提供了更多的潜在抗性基因。3.棉铃虫Clan 2和Clan M细胞色素P450基因的表达模式细胞色素P450在昆虫体内的时间/空间表达模式以及对外源化合物的响应通常与其功能有关。为了进一步了解棉铃虫Clan 2和Clan M中P450在生长发育和解毒代谢中发挥的作用,本研究通过转录组数据分析发现棉铃虫CYP333B3、CYP333A1和CYP18A1从卵到蛹的4个生长发育期和中肠、脂肪体、表皮等14个组织均有较高水平的表达。CYP303A1和CYP49A1在蛹期高表达,CYP307A2特异性在气管中高表达。此外,转录组结果显示,在花椒毒素诱导下,Clan 2中的CYP18B1被诱导上调2.1倍。定量PCR检测发现在顺式氰戊菊酯诱导下,Clan M中的CYP301A1,Clan 2中的CYP307A2、CYP15C1和CYP18A1被诱导上调,上调倍数为1.8倍左右。总体来说,两个集团的P450基因转录水平对两种外源化合物的响应程度有限。上述研究结果为Clan 2和Clan M P450功能的预测提供了重要信息。同时,外源化合物诱导和功能表达研究也表明了棉铃虫Clan 2

关键词：棉铃虫 Clan 2 P450 线粒体P450 解毒代谢外源化合物表达模式

转录因子AhR、ARNT调控褐飞虱解毒代谢机制

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

转录因子AhR、ARNT调控褐飞虱解毒代谢机制

作者：王越华中农业大学

学位级别：硕士

褐飞虱是水稻重要害虫,在我国造成严重的经济损失,目前化学防治是控制褐飞虱的主要措施。转录因子又被称作反式作用因子,可调控目的基因的表达强度,激活或抑制相关基因的转录。转录因子参与调控解毒酶基因的表达,进而影响害虫对杀虫剂... 详细信息

褐飞虱是水稻重要害虫,在我国造成严重的经济损失,目前化学防治是控制褐飞虱的主要措施。转录因子又被称作反式作用因子,可调控目的基因的表达强度,激活或抑制相关基因的转录。转录因子参与调控解毒酶基因的表达,进而影响害虫对杀虫剂的敏感性。本研究以褐飞虱为对象,探究了转录因子芳香烃受体（AhR）和芳香烃受体核转位蛋白（ARNT）在褐飞虱解毒代谢中的作用。主要结果如下:1.基于NCBI数据库,通过PCR扩增得到NlAhR和NlARNT的c DNA全长序列,开放阅读框长度分别为2580 bp和2109 bp,分别编码860个和703个氨基酸残基,均具有典型的b HLH-PAS结构域。系统发育分析表明,NlAhR与节瓜蓟马AhR同源性较高,NlARNT与红头松叶蜂和麦茎蜂ARNT同源性较高。2.通过qRT-PCR检测褐飞虱不同发育阶段和不同组织中NlAhR和NlARNT表达量,结果表明:NlAhR和NlARNT在褐飞虱每个发育阶段均有表达,且都在卵期表达量较高。NlAhR和NlARNT在所检测的褐飞虱组织中均有表达,NlAhR在头和体壁的表达量较高,NlARNT在头和中肠的表达量较高。分别使用吡虫啉、醚菊酯和异丙威胁迫处理褐飞虱,NlAhR和NlARNT表达量均显著上升,NlAhR上调31%-99%,NlARNT上调47%-58%。但毒死蜱处理对NlAhR和NlARNT表达无显著影响。3.基于RNAi分别干扰NlAhR和NlARNT,沉默后褐飞虱对吡虫啉、醚菊酯和异丙威的敏感性显著上升,但对毒死蜱的敏感性无显著差异。沉默NlAhR或NlARNT均显著抑制解毒酶P450、GST和Car E的活力。进一步发现干扰NlAhR后,2个P450基因、2个GST基因和2个Car E基因显著下调表达;而沉默NlARNT后5个P450基因、4个GST基因、1个Car E基因显著下调。此外,CYP301A1、Nl GSTt1和NlCarE7均在沉默NlAhR或NlARNT后显著下调表达,其中NlCarE7表达量分别显著下降85%和93%。4.为了进一步证实NlAhR/NlARNT对NlCarE7的调控作用,基于RNAi及双荧光素酶报告基因检测NlCarE7对褐飞虱敏感性的影响以及NlAhR/NlARNT对NlCarE7启动子活性的影响。结果表明,沉默NlCarE7后褐飞虱对醚菊酯和异丙威的敏感性显著上升,但对吡虫啉敏感性无显著差异。PCR克隆NlCarE7启动子区域并分析转录因子结合位点,发现NlCarE7启动子区域存在1个NlAhR/NlARNT结合位点。且双荧光素酶报告基因检测发现NlAhR/NlARNT可显著诱导NlCarE7启动子活性。以上结果表明NlAhR/NlARNT通过调控NlCarE7的表达介导褐飞虱对醚菊酯和异丙威的解毒代谢。

关键词：褐飞虱 AhR ARNT 转录调控解毒代谢 NlCarE7