ABC转运蛋白在二化螟对氯虫苯甲酰胺和阿维菌素解毒代谢中的作用研究
作者单位：扬州大学
学位级别：硕士
导师姓名：孟祥坤;徐健
授予年度：2021年
学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学]
摘 要：二化螟（Chilo suppressalis）是水稻作物上最主要的害虫之一。由于化学农药的不合理使用,导致二化螟对杀虫剂的抗药性迅速发展,进一步加大了防治难度。ABC转运蛋白（ATP-binding cassette transporter）是生物中最大的跨膜蛋白家族之一,广泛存在于古生菌、真细菌及真核生物中,能够对细胞中多种物质如脂类、氨基酸、多肽类、代谢产物、金属离子、毒素和化学治疗药物等进行跨膜转运。ABC转运蛋白参与对药物的吸收与排泄,而不经过其他酶的修饰,因此在药物代谢动力学机制上起重要作用。本研究利用RNA-Seq技术,对LC30亚致死剂量氯虫苯甲酰胺处理的二化螟幼虫进行比较转录组分析,探索氯虫苯甲酰胺对二化螟幼虫基因表达的影响。研究结果共鉴定出908个差异表达基因（DEGs）,其中441个基因表达上调,467个个基因表达下调。基因富集分析表明,下调的DEGs主要与糖类、能量、脂肪和氨基酸代谢及翻译后修饰有关,参与信号转导的大部分DEGs则上调表达。通过数据库检索,进一步将差异表达基因（DEGs）分类并富集在不同的功能类别和通路中,利用RT-qPCR对参与防御和解毒代谢的DEGs的表达变化进行验证。研究结果为理解二化螟的解毒代谢分子机制奠定基础。从二化螟基因组和转录组中共鉴定到54个ABC转运蛋白,通过Blast比对与系统发育分析,将ABC转运蛋白分为八个亚家族（ABCA-ABCH）,包括6个ABCA亚家族基因,10个ABCB亚家族基因,12个ABCC亚家族基因,2个ABCD亚家族基因,1个ABCE亚家族基因,3个ABCF亚家族基因,16个ABCG亚家族基因和4个ABCH亚家族基因。ABC转运蛋白基因序列的开放阅读框大小范围为1674bp（CsABCA13）到9273 bp（CsABCB1B）之间,编码558～3091个氨基酸,分子量大小在 60.96 kDa（CsABCA13）到341.55 kDa（CsABCB1B）之间,等电点介于5.55～9.26之间。系统发育分析表明,二化螟CsABCH与CsABCA和CsABCG家族的同源性最近,CsABCC与CsABCE和CsABCD具有较高的同源性,CsABCB与CsABCC具有很高的同源性。相同亚家族的基因聚为一支,且每个亚家族都有明显的功能聚类。杀虫剂增效作用实验表明,使用ABC转运蛋白抑制剂维拉帕米处理后可显著增加氯虫苯甲酰胺和阿维菌素对二化螟的毒力作用。结合转录组分析结果,对氯虫苯甲酰胺处理24小时后引起表达量变化的21个ABC基因进行验证,其中6个ABC转运蛋白基因显著上调,包括CsABCC8、CsABCG1C和CsABCH1等。经阿维菌素处理24小时后有6个ABC转运蛋白基因显著上调,包括CsABCA4、CsABCE1、CsABCF1、CsABCF2、CsABCC8和CsABCH1。同时测定了氯虫苯甲酰胺和阿维菌素处理后,ABC转运蛋白基因在解毒相关组织中的表达变化。利用RT-qPCR检测CsABCC8,CsACG1C和CsABCH1在二化螟不同发育阶段和不同组织的表达量,CsABCC8表达量明显高于CsABCG1C和CsABCH1在不同龄期的表达量,CsABCG1C和CsABCH1在幼虫阶段的表达量均较低。组织表达分析结果显示,CsABCC8基因在二化螟不同组织中的表达量均较高,在脑中的表达量最高。CsABCG1C和CsABCH1基因在二化螟神经索、脑和卵巢中均有较高表达,且CsABCG1C基因在二化螟表皮中也有较高的表达。为进一步验证二化螟ABC转运蛋白对杀虫剂的转运功能,我们对前期发现过表达的CsABCC8,CsABCG1C和CsABCH1等5个ABC基因的开放阅读框进行克隆并体外表达。通过构建稳定表达的pFastBACHTA真核表达体系,将二化螟CsABC和对照绿色荧光蛋白EGFP在昆虫Sf9细胞中重组表达。利用免疫荧光技术,检测到重组蛋白在细胞中成功表达。使用CCK8方法对表达不同重组蛋白的细胞毒性进行测定,在不使用杀虫剂处理下,表达CsABCC8、CsABCH1和CsABCE1的细胞活性显著高于表达EGFP的细胞活性。在使用杀虫剂处理下,相比于表达EGFP的细胞活性,表达CsABCC8、CsABCH1和CsABCE1蛋白的细胞活性进一步显著增加,表达的ABC蛋白增加了细胞对杀虫剂的外排作用从而显著降低杀虫剂对Sf9细胞的毒性。其中,相比于表达EGFP的细胞,表达CsABCC8和CsABCH1的细胞对氯虫本甲酰胺、溴氰虫酰胺、阿维菌素、氟虫腈和毒死蜱的细胞活性显著增加,表达CsABCE1的细胞对氯虫本甲酰胺、溴氰虫酰胺、阿维菌素、溴氰菊酯和茚虫威的细胞活性显著增加,说明二化螟CsABCC8、CsABCH1和CsABCCE1参与了对杀虫剂的转运代谢。本文研究结果为二化螟ABC蛋白转运代谢杀虫剂提供直接证据,进一步丰富了昆虫对杀虫剂的抗药性机制,为昆虫ABC转运蛋白的功能研究奠定了基础。
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