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蝮蛇毒血小板抑制因子对血小板信号通路影响及酶活性的研究

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蝮蛇毒血小板抑制因子对血小板信号通路影响及酶活性的研究

作者：季娜皖南医学院

学位级别：硕士

目的:探讨蝮蛇毒血小板抑制因子（platelet inhibitor from Askistrodon halys venom,AHV-PI）抑制血小板聚集的可能作用机制。方法:实验新西兰兔30只,随机分为:空白实验组,颈动脉血栓模型组,AHV-PI低剂量组（0.05mg/kg）、中剂量组（0.... 详细信息

目的:探讨蝮蛇毒血小板抑制因子（platelet inhibitor from Askistrodon halys venom,AHV-PI）抑制血小板聚集的可能作用机制。方法:实验新西兰兔30只,随机分为:空白实验组,颈动脉血栓模型组,AHV-PI低剂量组（0.05mg/kg）、中剂量组（0.1mg/kg）、高剂量组（0.2mg/kg）,阳性对照组（PI3K阻断剂LY294002,20u M）,共6个实验组,每组各5只。利用70%Fe Cl3通过化学损伤的方法制造家兔颈总动脉血栓模型,AHV-PI各剂量组经耳缘静脉注入相应体积的AHV-PI,空白实验组不复制模型,仅注入相同体积0.9%盐水。1h后经另一侧颈总动脉采血,离心取上清液,采用双通道凝血仪测定家兔凝血功能,ELISA方法测定各组血浆中纤溶酶（plasmin）、5-核苷酸酶（5-NT）、血小板膜糖蛋白Ib（GPIb）的含量,XS-1000I血球计数仪进行血小板计数,流式细胞术（FCM）观测AHV-PI干预下,荧光标识的单克隆抗体CD61（FITC-CD61）与血小板膜糖蛋白IIb/IIIa（GPIIb/IIIa）结合率的变化,蛋白质免疫印迹法（Western bloting）测定血小板内Akt蛋白激酶磷酸化程度。结果:病理切片显示AHV-PI中、高剂量组颈动脉内膜相对比较平滑,管腔内未见血栓形成。阳性对照组、AHV-PI中剂量组和高剂量组中血小板数目和蛋白激酶Akt磷酸化水平与模型组比较均下降（P＜0.05）,较空白实验组无明显改变（P＞0.05）,其中模型组与AHV-PI低剂量组之间、阳性对照组与AHV-PI中、高剂量组之间无明显差异（P＞0.05）。与空白实验组比较,模型组和AHV-PI低剂量组中活化部分凝血酶（APTT）、凝血酶原时间（PT）与凝血酶时间（TT）都显著缩短（P＜0.05）,血浆中FIB含量增高（P＜0.05）,纤溶酶水平下降（P＜0.05）,5-NT含量无显著变化（P＞0.05）,GPIb水平升高（P＜0.05）,中、高剂量组凝血功能指标中除PT、TT外均无明显改变（P＞0.05）,纤溶酶水平进一步下降（P＜0.05）,5-NT含量升高（P＜0.05）,GPIb含量降低（P＜0.05）;与模型组相比,AHV-PI中、高剂量组APTT、TT延长（P＜0.05）,PT无明显改变（P＞0.05）,血浆中FIB、纤溶酶和GPIb含量均下降（P＜0.05）,5-NT含量升高（P＜0.05）。除PT外,模型组与AHV-PI低剂量组之间和AHV-PI中、高剂量组之间相比以上各项指标差异无统计学意义（P＞0.05）。流式细胞术显示AHV-PI对单克隆抗体CD61与血小板GPIIb/IIIa的结合率没有显著影响（P＞0.05）。结论:AHV-PI抑制血小板聚集的机制可能是降低了蛋白激酶Akt磷酸化水平,阻碍Akt通路下游的信号转导;也可能与自身各种酶的活性有关,如纤溶酶原的激活、5-核苷酸酶能够分解血浆中相应的致聚成分。

关键词：蝮蛇毒动脉血栓血小板抑制因子纤溶酶原激活剂蛋白激酶

蝮蛇毒介导的心肌损伤与TNF-α表达的相关性

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中国急救医学 2012年第10期32卷 910-914页

作者：李招兵何军马小峰章若涵邓立普南华大学附属南华医院心内科湖南衡阳421001 南华大学附属南华医院检验科湖南衡阳421001 南华大学附属南华医院急诊科湖南衡阳421001

目的观察蝮蛇毒介导的心肌损伤与TNF-α的表达，探讨蝮蛇毒介导的心肌损伤的机制。方法96只小鼠随机分成12组（n=8），共设3个组：生理盐水（对照组）、蝮蛇毒＋生理盐水（实验组）、蝮蛇毒＋TNF-α抑制剂（干预组）；分4个时相点：1h、... 详细信息

目的观察蝮蛇毒介导的心肌损伤与TNF-α的表达，探讨蝮蛇毒介导的心肌损伤的机制。方法96只小鼠随机分成12组（n=8），共设3个组：生理盐水（对照组）、蝮蛇毒＋生理盐水（实验组）、蝮蛇毒＋TNF-α抑制剂（干预组）；分4个时相点：1h、12h、24h和48h。ELISA检测血清cTnT水平，观察心肌组织病变，免疫组化检测心肌组织TNF-α蛋白的表达。对心肌病变积分、血清cTnT水平与心肌TNF-α表达行直线相关分析。结果实验组各时相点心肌病变积分和心肌TNF-α蛋白表达均高于干预组和对照组（P〈0．05），干预组各时相点均高对照组（P〈0．05），实验组和干预组48h〉24h〉12h〉1h（P〈0．05）；除1h组外，实验组各时相点血清cTnT水平均高于干预组及对照组（P〈0．05），干预组各时相点高于对照组（P〈0．05），实验组和干预组48h〉24h〉12h〉lh（P〈0．05）；小鼠心肌病变积分与心肌TNF-α表达呈显著正相关（r=0．728，P〈0．05），小鼠血清cTnT水平与心肌TNF-α表达呈显著正相关（，=0．666．P〈0．05）。结论蝮蛇毒可致小鼠急性心肌损伤，随时间的延长，心肌损伤越严重。TNF-α抑制剂能降低蝮蛇毒介导的心肌损伤程度、血清cTnT水平及心肌TNF-α蛋白的表达。TNF-α的过度表达可能是蝮蛇毒介导心肌损伤的机制之一。

关键词：蝮蛇毒心肌损伤 TNF-α

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蝮蛇毒对大鼠肝脏毒性损伤作用研究

蝮蛇毒对大鼠肝脏毒性损伤作用研究

蝮蛇毒介导的小鼠急性肝损伤及血清p-选择素水平的表达

中国毒理学会第九次全国毒理学大会

作者：董德刚邓中平上海中医药大学创新中药研究院江西中医药大学生命科学学院

目的探讨蝮蛇毒对大鼠肝脏毒性损伤作用。材料与方法随机选取SD大鼠58只,体重200+20 g,雌雄各半,在屏障环境下,通过肌肉注射蝮蛇毒(25μg·kg)建立蝮蛇伤大鼠模型,分别在注射蛇毒后4、12、24、36、48以及72h腹主动脉取血,并收集肝脏,全... 详细信息

目的探讨蝮蛇毒对大鼠肝脏毒性损伤作用。材料与方法随机选取SD大鼠58只,体重200+20 g,雌雄各半,在屏障环境下,通过肌肉注射蝮蛇毒(25μg·kg)建立蝮蛇伤大鼠模型,分别在注射蛇毒后4、12、24、36、48以及72h腹主动脉取血,并收集肝脏,全自动生化仪检测各组大鼠AST、ALT、ALP、LDH、CK等血清肝功能指标,ELISA检测各组血清IL-1β、IL-18水平,各组肝脏分别进行HE染色、PAS染色以及油红O染色,在酶学、病理学及炎症水平上观察蝮蛇毒对大鼠肝毒性效应。结果在72 h内死亡4只(共58只),死亡率约为7%,死亡时间集中在12-36 h内,各组在注射蛇毒后各项肝功能指标和炎症因子水平显著升高,在24 h为峰值,其中ALP存在性别差异。HE染色显示12 h时出现肝细胞肿大,部分肝细胞坏死,在36 h时表现最显著。PAS染色显示28h有糖原增多,48 h糖原增多最显著,油红O染色显示28h出现脂肪变性,72 h最显著。72 h后观察到各项血清学指标及病理学均趋于正常,大鼠局部创面结痂愈合。结论蝮蛇毒能导致显著的肝毒性,且存在时效相关性,肝功能损伤峰值期早于病理学最显著期,这为蛇伤诊治及蛇毒药物开发提供了一定实验依据与参考。

关键词：蝮蛇毒大鼠肝毒性时效关系

来源： cnki会议评论

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中华急诊医学杂志 2012年第5期21卷 503-506页

作者：钟哲峰邓立普陈坤南华大学附属南华医院感染科湖南省衡阳421002

目的探讨蝮蛇毒介导的小鼠急性肝损伤肝脏病理变化、血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）及血清中P-选择素（P-selectin）水平的变化，与不同蝮蛇毒剂量、中毒时间的关系。方法将72只清洁级昆明雄性小鼠采用两因素析因设计随机（随机数字法）分... 详细信息

目的探讨蝮蛇毒介导的小鼠急性肝损伤肝脏病理变化、血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）及血清中P-选择素（P-selectin）水平的变化，与不同蝮蛇毒剂量、中毒时间的关系。方法将72只清洁级昆明雄性小鼠采用两因素析因设计随机（随机数字法）分成9组，每组8只小鼠，蝮蛇毒设三水平：零剂量（0．0mg／kg）、低剂量（0．5mg／kg）、高剂量（1．0mg／kg）；中毒时间设3水平：3、8、24h。采集小鼠血清及肝脏标本，观察肝脏病理变化、ALT、P-选择素表达。结果肌注蝮蛇毒的实验组小鼠肝脏病理积分、血清ALT、血清P-选择素值明显高于肌注生理盐水的对照组（P〈0．05）；高剂量组高于低剂量组（P〈0．05）；8h组高于3h组（P〈0．05）；24h组高于8h组（P〈0．05）；随着蝮蛇毒剂量的增加、中毒时间的延长病理积分越高，血清ALT值越高，血清P．选择素含量越高。血清中P-选择素表达水平与肝脏病变积分相关性分析，两者呈正相关（r=0．98，P〈0．05）。结论蝮蛇毒可以导致小鼠急性肝损伤，AIJT值升高，P-选择素表达增高，呈一定的时间、剂量效应趋势。蝮蛇毒导致小鼠急性肝脏损伤与P-选择素表达增高相关，提示血清中P-选择素表达增高可能是蝮蛇毒导致小鼠急性肝脏损伤的机制之一。

关键词：蝮蛇毒急性肝损伤 P-选择素丙氨酸氨基转移酶小鼠

蝮蛇毒血小板抑制因子对家兔动脉血栓形成的影响

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中国临床药理学与治疗学 2014年第9期19卷 987-990页

作者：季娜张根葆黄璐王斐张娅吴娟皖南医学院病理生理学教研室皖南医学院蛇毒研究所

目的:研究蝮蛇毒血小板抑制因子(AHVPI)对实验家兔动脉血栓形成的影响及其可能机制。方法:30只雄性家兔随机分为3组(n=10),即对照组(假手术组),模型组,AHV-PI组(0.2mg/kg)。以70%FeCl3溶液化学损伤的方法制备家兔颈动脉血栓模型。1h后... 详细信息

目的:研究蝮蛇毒血小板抑制因子(AHVPI)对实验家兔动脉血栓形成的影响及其可能机制。方法:30只雄性家兔随机分为3组(n=10),即对照组(假手术组),模型组,AHV-PI组(0.2mg/kg)。以70%FeCl3溶液化学损伤的方法制备家兔颈动脉血栓模型。1h后经另一侧颈动脉采血,用双通道凝血仪测定家兔APTT、PT与TT以及血浆纤维蛋白原(FIB)含量,酶联免疫吸附法(ELISA)测定各血浆中纤溶酶水平。结果:与对照组相比较,模型组APTT、PT与TT均明显缩短(P0.05),血浆中FIB含量降低(P<0.05),纤溶酶含量进一步降低(P<0.05)。病理切片显示AHV-PI组颈动脉内膜相对比较平滑,管腔内未见血栓形成。结论:AHV-PI抑制动脉血栓形成,其机制可能与纤溶酶激活有关。

关键词：蝮蛇毒动脉血栓纤溶酶原激活

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蝮蛇毒蛋白C激活物的纯化与活性分析

中国输血杂志 2011年第4期24卷 299-303页

作者：章俊肖小璞李长清王宗奎林方昭中国医学科学院北京协和医学院输血研究所四川成都610052

目的探索从国产蝮蛇毒中分离纯化人血浆蛋白C激活物(PCA)的方法及其用于蛋白C的鉴定。方法以国产蝮蛇毒为原料,通过溶解、离心、透析,利用Q Sepharose Fast Flow离子交换层析和Superdex G75凝胶过滤法分离纯化PCA组份。通过SDS-PAGE观察... 详细信息

目的探索从国产蝮蛇毒中分离纯化人血浆蛋白C激活物(PCA)的方法及其用于蛋白C的鉴定。方法以国产蝮蛇毒为原料,通过溶解、离心、透析,利用Q Sepharose Fast Flow离子交换层析和Superdex G75凝胶过滤法分离纯化PCA组份。通过SDS-PAGE观察PCA组份的分子量,用发色底物法和凝固法分别测定活化PC(APC)的酰胺酶活性和抗凝活性。结果经两步层析,从蝮蛇粗蛇毒中纯化出PCA组份,SDS-PAGE图谱显示在分子量51 kD左右呈现1条蛋白带;经生物学活性鉴定:该组份在体外能迅速将PC激活为APC,APC的酰胺酶活性(A405)最高约为Protac(唯一商品化的PC激活剂产品)作用的2.8倍,抗凝活性(秒值)最高约为Protac作用的1.4倍,比活性2.20 IU/mg;不同浓度组份激活PC的酰胺酶活性和抗凝活性均随组份浓度的增大而升高,有明显的量效关系。结论采用离子交换层析和凝胶过滤法,可以从国产蝮蛇粗蛇毒中分离纯化出PCA组份,该组份具有较强的激活PC的能力,其生物活性与浓度呈正相关。

关键词：蝮蛇毒纯化活性蛋白C特异性激活剂 PCA组份

GSH对蝮蛇毒致小鼠急性肾损伤后氧化应激和炎症反应的保护作用

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GSH对蝮蛇毒致小鼠急性肾损伤后氧化应激和炎症反应的保护作用

作者：杨悦南华大学

学位级别：硕士

目的:观察GSH对蝮蛇毒致小鼠急性肾损伤后SOD活性、MDA含量、IL-6及TNF-α表达水平指标的影响,探讨GSH对蝮蛇毒致小鼠急性肾损伤的保护机制。方法:将60只雌性昆明小鼠按照随机分配的原则分成6组:正常对照组（A组）、还原型谷胱甘肽对照... 详细信息

目的:观察GSH对蝮蛇毒致小鼠急性肾损伤后SOD活性、MDA含量、IL-6及TNF-α表达水平指标的影响,探讨GSH对蝮蛇毒致小鼠急性肾损伤的保护机制。方法:将60只雌性昆明小鼠按照随机分配的原则分成6组:正常对照组（A组）、还原型谷胱甘肽对照组（B组）、低剂量蛇毒干预组（C组）、低剂量蛇毒干预+还原型谷胱甘肽治疗组（D组）、高剂量蛇毒干预组（E组）、高剂量蛇毒干预+还原型谷胱甘肽治疗组（F组）。分别用生理盐水处理正常对照组（A组）及还原型谷胱甘肽对照组（B组）。用0.75mg/kg浓度的蝮蛇毒注射低剂量蛇毒干预组（C组）及低剂量蛇毒干预+还原型谷胱甘肽治疗组（D组）,用1.00mg/kg浓度的蝮蛇毒注射高剂量蛇毒干预组（E组）及高剂量蛇毒干预+还原型谷胱甘肽治疗组（F组）。3小时后还原型谷胱甘肽（1800mg/kg）注射蛇毒干预+还原型谷胱甘肽治疗组（D组、F组）,同样为还型谷胱甘肽对照组注射同等剂量还原型谷胱甘肽。注射还原型谷胱甘肽后5小时后收集眼球血及肾脏标本,制作肾脏病理切片并进行病理评分,外周血检测血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）,ELISA法测白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）。结果:1、A组及B组的小鼠始终无异常,C组、E组及D组、F组的小鼠在注射蝮蛇毒之后出现精神萎靡、蜷伏成团、活动量减少、鼠毛杂乱、拒绝进水、拒绝进食等中毒病象,注射还原型谷胱甘肽治疗后D组小鼠活动精神状态好转、进食及活动明显增多,与A组及B组无明显差异,F组偶有活动、进食,较E组好转,但仍有蜷伏成团、毛发凌乱等现象,较A组或B组状态仍差。2、C组及E组、F组的SCr、BUN、MDA、SOD、TNF-α、IL-6明显区别于A组（P＜0.05）及B组,D组SCr、BUN、MDA、TNF-α与A组相比无明显差异（P＞0.05）,D组的SOD、IL-6介于A组与C组之间,和两组比较都有差异（P＜0.05）,F组的SCr、BUN、SOD、MDA、IL-6、TNF-α与A组比较有差异（P＜0.05）,与E组比较无统计学意义（P＞0.05）。3、C组及E组的病理切片下肾小管上皮细胞肿胀,细胞核脱落、小管腔出现萎缩或塌陷,部分小管腔出现蛋白管型,细胞之间也可见大量空泡。间质间可见炎症细胞（单核或中性粒细胞）浸润,间质扩张伴有小管扭曲。其中E组以上特征尤为明显,D组减少明显,F组与E组无明显好转。结论:1、还原型谷胱甘肽使蝮蛇毒致急性肾损伤小鼠的MDA的含量、TNF-α、IL-6的表达水平下降,SOD活性升高。2、还原型谷胱甘肽对蝮蛇毒致小鼠肾损伤的保护作用与减轻氧化应激及炎症反应有关。

关键词：蝮蛇毒小鼠急性肾损伤还原型谷胱甘肽

蝮蛇毒血小板抑制因子对动脉血栓形成的影响及机制研究

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中国临床药理学与治疗学 2012年第12期17卷 1355-1360页

作者：黄璐张根葆闵志雪马开然郑汝琦孙瑶吴娟皖南医学院病理生理学教研室皖南医学院蛇毒研究所

目的:探讨皖南蝮蛇毒血小板抑制因子(AHV-PI)对家兔动脉血栓形成的影响及可能机制。方法:新西兰家兔24只,随机分成假手术组、动脉血栓模型组、阳性对照组(奥扎格雷钠,5mg/kg),AHV-PI(0.1mg/kg)实验组共4组,每组6只。应用70%FeCl3溶液化... 详细信息

目的:探讨皖南蝮蛇毒血小板抑制因子(AHV-PI)对家兔动脉血栓形成的影响及可能机制。方法:新西兰家兔24只,随机分成假手术组、动脉血栓模型组、阳性对照组(奥扎格雷钠,5mg/kg),AHV-PI(0.1mg/kg)实验组共4组,每组6只。应用70%FeCl3溶液化学损伤的方法来制备家兔颈动脉血栓模型,采用血栓弹力仪(TEG)描计血栓弹力图,比浊法测定家兔血小板聚集率,ELISA测定各组血浆中α颗粒膜蛋白(GMP-140)和血栓素B2(TXB2)水平,光镜和透射电镜分别观察动脉血栓形成和血小板形态的改变。结果:AHV-PI实验组与模型组相比,血栓弹力图凝血时间(R)值和血凝块形成时间(K)值延长(P<0.01和P<0.05),Alpha角度、最大幅度(MA)和凝血指数(CI)减小(P<0.05和P<0.01);血小板聚集率的各项指标均明显降低(P<0.05);血浆中GMP-140和TXB2含量降低(P<0.01)。AHV-PI实验组光镜下动脉内未见血栓形成,血小板电镜显示血小板形态基本规则,与模型组相比伪足较少,α-颗粒和致密颗粒无明显减少,胞浆空泡化现象减轻。结论:AHV-PI可以通过抑制血小板聚集,防止动脉血栓的形成,其机制可能与之保护血小板超微结构,减少血小板脂质代谢和颗粒内容物的释放有关。

关键词：蝮蛇毒血小板抑制因子动脉血栓血小板

蝮蛇毒蛋白C激活物改善急性心肌梗死大鼠心功能的机制研究

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中国临床药理学与治疗学 2012年第2期17卷 141-146页

作者：李曙张根葆洪云陆晓华皖南医学院病理生理学教研室皖南医学院蛇毒研究所皖南医学院弋矶山医院超声医学科皖南医学院机能实验中心

目的:探讨皖南产蝮蛇毒(AHV)蛋白C激活物(protein C activator,PCA)改善急性心肌梗死大鼠心功能作用与机制。方法:Sprague-Daw-ly大鼠60只,随机分为假手术(SH)组、心肌梗死模型(MI)组、PCA低、中、高剂量组(0.5、2、8mg/kg)、阳性对照组... 详细信息

目的:探讨皖南产蝮蛇毒(AHV)蛋白C激活物(protein C activator,PCA)改善急性心肌梗死大鼠心功能作用与机制。方法:Sprague-Daw-ly大鼠60只,随机分为假手术(SH)组、心肌梗死模型(MI)组、PCA低、中、高剂量组(0.5、2、8mg/kg)、阳性对照组(阿司匹林5mg/kg),每组10只。通过结扎冠状动脉前降支建立急性心肌梗死(AMI)模型,采用Medlab生物信号处理系统监测大鼠心脏血流动力学变化。Westernblot检测心肌基质金属蛋白酶-9(MMP-9)蛋白表达;光镜观察心肌组织学改变。结果:与心肌梗死组比较,PCA高、中剂量大鼠左室内压最低值(LVDP)、左心室舒张末期压(LVEDP)、左心室压力最大上升速率(+dp/dtmax)、左心室压力最大下降速率(-dp/dtmax)明显升高(P蝮蛇毒PCA组分可以限制急性心肌梗死早期心肌梗死扩大,有效改善心脏血液动力学,抑制MMP-9表达,对急性心肌梗死后心室重构有一定的干预作用。

关键词：蝮蛇毒蛋白C激活物心肌梗死心室重构基质金属蛋白酶