蝮蛇毒血小板抑制因子对血小板信号通路影响及酶活性的研究

作     者：季娜 

作者单位：皖南医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：张根葆

授予年度：2015年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100204[医学-神经病学] 10[医学] 

主      题：蝮蛇毒 动脉血栓 血小板抑制因子 纤溶酶原激活剂 蛋白激酶 

摘      要：目的:探讨蝮蛇毒血小板抑制因子（platelet inhibitor from Askistrodon halys venom,AHV-PI）抑制血小板聚集的可能作用机制。方法:实验新西兰兔30只,随机分为:空白实验组,颈动脉血栓模型组,AHV-PI低剂量组（0.05mg/kg）、中剂量组（0.1mg/kg）、高剂量组（0.2mg/kg）,阳性对照组（PI3K阻断剂LY294002,20u M）,共6个实验组,每组各5只。利用70%Fe Cl3通过化学损伤的方法制造家兔颈总动脉血栓模型,AHV-PI各剂量组经耳缘静脉注入相应体积的AHV-PI,空白实验组不复制模型,仅注入相同体积0.9%盐水。1h后经另一侧颈总动脉采血,离心取上清液,采用双通道凝血仪测定家兔凝血功能,ELISA方法测定各组血浆中纤溶酶（plasmin）、5-核苷酸酶（5-NT）、血小板膜糖蛋白Ib（GPIb）的含量,XS-1000I血球计数仪进行血小板计数,流式细胞术（FCM）观测AHV-PI干预下,荧光标识的单克隆抗体CD61（FITC-CD61）与血小板膜糖蛋白IIb/IIIa（GPIIb/IIIa）结合率的变化,蛋白质免疫印迹法（Western bloting）测定血小板内Akt蛋白激酶磷酸化程度。结果:病理切片显示AHV-PI中、高剂量组颈动脉内膜相对比较平滑,管腔内未见血栓形成。阳性对照组、AHV-PI中剂量组和高剂量组中血小板数目和蛋白激酶Akt磷酸化水平与模型组比较均下降（P0.05）,较空白实验组无明显改变（P0.05）,其中模型组与AHV-PI低剂量组之间、阳性对照组与AHV-PI中、高剂量组之间无明显差异（P0.05）。与空白实验组比较,模型组和AHV-PI低剂量组中活化部分凝血酶（APTT）、凝血酶原时间（PT）与凝血酶时间（TT）都显著缩短（P0.05）,血浆中FIB含量增高（P0.05）,纤溶酶水平下降（P0.05）,5-NT含量无显著变化（P0.05）,GPIb水平升高（P0.05）,中、高剂量组凝血功能指标中除PT、TT外均无明显改变（P0.05）,纤溶酶水平进一步下降（P0.05）,5-NT含量升高（P0.05）,GPIb含量降低（P0.05）;与模型组相比,AHV-PI中、高剂量组APTT、TT延长（P0.05）,PT无明显改变（P0.05）,血浆中FIB、纤溶酶和GPIb含量均下降（P0.05）,5-NT含量升高（P0.05）。除PT外,模型组与AHV-PI低剂量组之间和AHV-PI中、高剂量组之间相比以上各项指标差异无统计学意义（P0.05）。流式细胞术显示AHV-PI对单克隆抗体CD61与血小板GPIIb/IIIa的结合率没有显著影响（P0.05）。结论:AHV-PI抑制血小板聚集的机制可能是降低了蛋白激酶Akt磷酸化水平,阻碍Akt通路下游的信号转导;也可能与自身各种酶的活性有关,如纤溶酶原的激活、5-核苷酸酶能够分解血浆中相应的致聚成分。