检索结果-南通市图书馆

生物学教学 2024年第3期49卷 46-49页

作者：陈开灯广东省广州市铁一中学广州511447

通过创设天然枯草杆菌蛋白酶的科研情境,引发思维动机。通过聚焦蛋白质工程的基本原理和应用的四个问题,激发思维动力。学生自主探究,保持思维主动并合作交流,引发思维监控。在蛋白质工程的现实应用中促发思维的迁移。

关键词：蛋白质工程思维型课堂高中生物学

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蛋白质工程在饲料用酶研发中的应用研究进展

合成生物学 2022年第3期3卷 487-499页

作者：涂涛罗会颖姚斌动物营养学国家重点实验室中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京100193

饲料用酶制剂作为饲料添加剂领域最为热门的研究热点之一,以其无残留、无污染、无耐药性等强势优势被广泛推广和应用,极大促进了饲料行业的健康发展。其中,饲料用酶的催化性能是决定其应用功效的核心因素,如何提高饲料用酶的综合性能是... 详细信息

饲料用酶制剂作为饲料添加剂领域最为热门的研究热点之一,以其无残留、无污染、无耐药性等强势优势被广泛推广和应用,极大促进了饲料行业的健康发展。其中,饲料用酶的催化性能是决定其应用功效的核心因素,如何提高饲料用酶的综合性能是饲料用酶制剂研发过程中面临的关键科学问题之一。本文从饲料用酶的实际应用需求出发,聚焦饲料用酶的热稳定性、pH依赖性、蛋白酶抗性和催化活性等4个方面,综述了计算机辅助的蛋白质理性设计技术在饲料用酶制剂研发中的应用研究进展,介绍了用于提升饲料用酶催化性能的有效分子设计策略。通过蛋白质工程技术在关键饲料用酶制剂研发中的应用案例介绍,展示了基于结构基础的酶分子设计技术在饲料用酶制剂研发中的应用前景。与此同时,作为一种应用导向极强的饲料添加剂,利用合成生物学的思想从酶蛋白全局角度出发综合提升饲料用酶催化性能的发展方向,将推动饲料用酶制剂环境适应性分子设计的研发迈向新的台阶。

关键词：饲料用酶蛋白质工程分子设计热稳定性 pH依赖性蛋白酶抗性催化活性

蛋白质工程改造丙酮酸脱羧酶提升酪醇产量的研究

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蛋白质工程改造丙酮酸脱羧酶提升酪醇产量的研究

作者：徐欢欢江南大学

学位级别：硕士

酪醇(Tyrosol)作为具有药理活性的芳香醇类化合物,被广泛应用于医药和化工领域。酪醇可由本实验室之前构建的四酶级联路径进行全细胞转化合成,但路径中来源于Candida tropicalis的丙酮酸脱羧酶(CtPDC)活性低,催化中间产物对羟基苯丙酮酸... 详细信息

酪醇(Tyrosol)作为具有药理活性的芳香醇类化合物,被广泛应用于医药和化工领域。酪醇可由本实验室之前构建的四酶级联路径进行全细胞转化合成,但路径中来源于Candida tropicalis的丙酮酸脱羧酶(CtPDC)活性低,催化中间产物对羟基苯丙酮酸(4-hydroxyphenylpyruvic acid,4-HPP)的脱羧效率低,是合成酪醇级联路径中的限速酶。本研究首次解析了CtPDC的晶体结构,并对其催化机制进行了分析。以结构和机制为基础,对变构酶CtPDC进行蛋白质工程改造,获得的最优突变体提升了酶活和脱羧转化率;后续通过分子动力学(molecular dynamics,MD)模拟等手段解析了突变体性能提升的机制。将CtPDC最优突变体应用于酪醇的生产,通过后续的条件优化进一步提升了酪醇的产量,并实现了3 L发酵罐内放大体系的酪醇制备。主要的研究结果如下:(1)确定合成酪醇级联路径中的限速酶。首先,在不同底物浓度下进行L-酪氨酸的全细胞转化实验,测定反应液中各物质的量,发现随着底物浓度的升高,CtPDC催化的底物4-HPP出现逐渐积累的现象;随后进行了纯酶的体外转化实验,在体外仅增加CtPDC的量发现4-HPP的积累现象缓解,加之对4个纯酶的动力学参数测定,发现CtPDC的催化效率最低。以上结果确定了限速酶为CtPDC。(2)CtPDC的蛋白质结晶和结构机制解析。首先,对重组菌株E.coli-p ET28a-CtPDC进行分离纯化。先利用商业化晶体筛选试剂盒进行结晶条件的初筛,确定结晶条件后进行复筛优化,在最优条件下获得分辨率分别为3.05?的空蛋白晶体(PDB编号为8HP2)与2.52?的蛋白-辅因子复合物晶体(PDB编号为8HP4);随后对得到的晶体结构进行亚基聚合方式及二级结构的分析,并通过分子对接后的突变验证,确定了催化区和变构区的关键残基;最后推测了CtPDC的底物变构激活机制及脱羧机制。(3)蛋白质工程改造提升CtPDC脱羧活性。为了促进催化区的脱羧效率,基于底物结合在变构区引起的变构调节进行蛋白质工程改造,最后获得最优突变体Mu的酶活相较于野生型WT提升了10.1倍,脱羧转化率提升了120.9%;随后通过MD模拟和结合自由能计算结果发现:Mu模型中的底物结合更加稳定,涉及到催化区ylide中心形成(C2去质子化)的两个关键距离(D_((O-G415/S415)-H4’)和D)都有所缩短,随后发现亲核进攻距离从3.8?缩短为3.0?,进一步从代表性快照的对比发现整个变构传输通路从20.4?缩短至18.6?,变构传输通路两侧的Loop环也变得更加灵活。(4)CtPDC在酪醇合成中的应用。将原本路径中的CtPDC以CtPDC替换,虽然路径中4-HPP的积累减少,但效果并不显著。随后通过SDS-PAGE分析发现蛋白表达失衡,所以通过双质粒载体组合优化调整了四个酶的表达水平。而后进行了转化条件的优化,相比于之前的研究,缩短了反应时间并降低了辅因子Th DP的添加量;最后,在3 L发酵罐中放大,在反应24 h后,酪醇产量为38.0 g·L,转化率达到99.6%,时空产率为1.6 g·L·h。

关键词：酪醇丙酮酸脱羧酶蛋白质工程分子动力学模拟

基于BOPPPS+翻转课堂的“蛋白质工程”线上线下混合式教学模式探索

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生物工程学报 2023年第7期39卷 3037-3048页

作者：袁建琴唐中伟史宗勇李毛唐锐敏山西农业大学生命科学学院山西太谷030801 农业农村部农作物生态环境安全监督检验测试中心(太原) 山西太谷030801

“蛋白质工程”是山西省一流本科专业建设点生物技术专业的核心必修课程。为了解决“蛋白质工程”课堂教学模式单一、传授式教学学生参与度不够、听课不认真、授课时间缩短、实验价格昂贵等问题,课程团队进行了“蛋白质工程”课程教学... 详细信息

“蛋白质工程”是山西省一流本科专业建设点生物技术专业的核心必修课程。为了解决“蛋白质工程”课堂教学模式单一、传授式教学学生参与度不够、听课不认真、授课时间缩短、实验价格昂贵等问题,课程团队进行了“蛋白质工程”课程教学模式改革与实践,提出了适合生物技术专业的“蛋白质工程”教学新策略:构建了基于BOPPPS+翻转课堂的教学模式,线下课堂讲授与学生在线自主学习与完成作业、章节测验和讨论等相结合,全面融入翻转课堂;特别是在“金课”两性一度标准的指导下,课程团队自建慕课(massive open online courses,MOOC)课程资源,利用超星泛雅网络教学平台开展BOPPPS+翻转课堂的“蛋白质工程”线上线下混合式教学工作,构建了全面、系统及动态的“蛋白质工程”课程新教学体系。经过3轮的教学实践表明,课程团队在“蛋白质工程”课程资源建设、探究性实验辅导、课堂研讨设计,以及课程成绩评定方式等方面形成了一套完整、可复制、科学、合理的线上线下混合式教学模式。基于BOPPPS+翻转课堂的“蛋白质工程”线上线下混合式教学模式有助于提高学生的自主学习能力,使学生深度参与到教学的全过程,对“蛋白质工程”有了全面深刻的认识,提高了“蛋白质工程”的教学质量,为后续学生学习其他专业课程奠定了基础,也为课程教学改革提供了参考。

关键词：蛋白质工程 BOPPPS模式翻转课堂线上线下混合式教学改革

蛋白质工程改造磷脂酶D提高磷脂酰丝氨酸产量

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食品工业科技 2020年第17期41卷 98-103,108页

作者：冯小娜齐娜宋伟刘佳刘立明吴静江南大学药学院江苏无锡214122 江南大学食品科学与技术国家重点实验室江苏无锡214122

为了进一步提高磷脂酰丝氨酸(PS)产量,将来源于Streptomyces katrae的野生型磷脂酶D(SkPLD)于E.coli BL21(DE3)中进行异源表达,获得菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-SkPLD,以磷脂酰胆碱(PC)和L-serine为底物,发现限制PS产量进一步提高的限制因素是转磷脂酰反应转化率低(30%)。在对SKPLD结构进行详尽分析的基础上,通过蛋白质工程改造策略扩大底物催化通道,降低位阻效应;同时提高His462与L-serine的亲和力,降低水解反应。结果表明,获得4个有益单突变体(Y405A、Q407G、D370P、K478P),对其进行组合突变,获得四突变体SkPLDY405A/Q407G/D370P/K478P,转化率、PS产量、kcat/Km分别为55.6%、42.3 g·L-1、1.53 (mmol/L)-1s-1,比野生型分别提高了59.8%、59.6%、93.7%。PS产量进一步提高的原因在于四突变体催化腔体积扩大到718.6■3,且His462 N原子与L-serine O原子的催化距离(d1)缩短0.6■,与H2O O原子的距离(d2)增加0.8■。在3 L规模转化体系中,PS产量为50.4 g·L-1、转化率达到66.3%,时空产率为12.6 g/L/h。本研究利用蛋白质工程改造获得了转磷脂酰活性提高的突变体,为提高磷脂酶D的工业生产奠定了坚实的基础。

关键词：蛋白质工程磷脂酶D 磷脂酰丝氨酸催化通道催化距离定点突变

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蛋白质工程改造脂肪酶对映选择性的研究进展

武汉工程大学学报 2022年第2期44卷 119-126页

作者：黄金莎代姝函徐莉闫云君华中科技大学生命科学与技术学院分子生物物理教育部重点实验室(华中科技大学)湖北武汉430074

脂肪酶已被广泛应用于手性化合物拆分,但天然脂肪酶催化效率低、对非天然底物的选择性较差。为满足工业应用需求,开发具有高效对映体选择性的脂肪酶具有十分重要的意义;当前通过蛋白质工程改造获取高效脂肪酶已成为主流策略。鉴于脂肪... 详细信息

脂肪酶已被广泛应用于手性化合物拆分,但天然脂肪酶催化效率低、对非天然底物的选择性较差。为满足工业应用需求,开发具有高效对映体选择性的脂肪酶具有十分重要的意义;当前通过蛋白质工程改造获取高效脂肪酶已成为主流策略。鉴于脂肪酶催化受化学反应的环境影响较大,系统分析了脂肪酶与外消旋底物作用的关键区域(酰基结合口袋、疏水腔、亲水腔和氧阴离子洞)特性,重点综述了近年外消旋羧酸和外消旋醇拆分反应中影响脂肪酶对映选择性的重要突变位点相关研究进展。相比于传统从自然界中筛选具有特定选择性脂肪酶资源方法,蛋白质工程,特别是计算机辅助的理性设计,能大幅缩短脂肪酶进化历程,且能使其朝着预设方向进化。可以预期,随着运用蛋白质工程改造脂肪酶对映选择性研究的进一步深入发展,将可实现特定外消旋化合物的酶法高效手性拆分,也可为定向开发具特殊活性的生物催化剂提供新的研究思路。

关键词：脂肪酶对映选择性催化裂缝关键突变位点外消旋底物拆分蛋白质工程

“蛋白质工程的原理和应用”思维型课堂教学设计

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生物学教学 2023年

作者：陈开灯广东省广州市铁一中学

关键词：蛋白质工程思维型课堂高中生物学

蛋白质工程技术及其在药用天然产物合成生物学中的应用研究进展

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药学学报 2024年第6期 1601-1615页

作者：孙晓燕陈晶晶陈天娇巩婷杨金玲朱平北京协和医学院药物研究所天然药物活性物质与功能国家重点实验室中国医学科学院酶与天然药物生物催化重点实验室国家卫生健康委员会天然药物生物合成重点实验室中国医学科学院

天然产物是药物发现的重要源泉。通过传统提取分离和化学合成方法获得天然产物时,存在操作复杂、成本高、效率低和易造成环境污染等问题。利用合成生物学方法构建微生物细胞工厂以生产药用天然产物具有高效、低成本和绿色环保的优势。然... 详细信息

天然产物是药物发现的重要源泉。通过传统提取分离和化学合成方法获得天然产物时,存在操作复杂、成本高、效率低和易造成环境污染等问题。利用合成生物学方法构建微生物细胞工厂以生产药用天然产物具有高效、低成本和绿色环保的优势。然而,在微生物细胞工厂中,由于酶的局限性,限制了产物范围和产量提高。蛋白质工程被认为是克服这些问题最有效的方法之一。本文介绍了蛋白质工程技术的常用方法,综述了蛋白质工程技术在药用天然产物合成生物学领域改善酶的性能及作用环境、促进合成生物学工具发展等方面的具体应用,还分析了蛋白质工程目前存在的瓶颈和面临的挑战,并对其应用前景进行了展望,可为蛋白质工程技术发展和应用提供借鉴。

关键词：药用天然产物生物合成酶蛋白质工程合成生物学

大概念教学视角下“蛋白质工程的原理和应用”教学设计

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生物学教学 2024年第4期49卷 28-32页

作者：王坤谢建华陈欣广东省广州市第六中学广州510300

以“转基因抗虫棉的培育和应用”情境贯穿大概念“基因工程赋予生物新的遗传特性”的学习,在“蛋白质工程的原理和应用”一节的教学中,以“改造Bt蛋白,增强杀虫效果”为主要任务,引导学生在解决问题的过程中,深刻理解蛋白质分子结构与... 详细信息

以“转基因抗虫棉的培育和应用”情境贯穿大概念“基因工程赋予生物新的遗传特性”的学习,在“蛋白质工程的原理和应用”一节的教学中,以“改造Bt蛋白,增强杀虫效果”为主要任务,引导学生在解决问题的过程中,深刻理解蛋白质分子结构与功能的关系,初步建构蛋白质工程的概念,同时应用概念尝试设计抗新冠病毒药物蛋白,发展完善概念,以达到对蛋白质工程概念的深度学习以及结构与功能观、生命信息观的培养。

关键词：大概念教学蛋白质工程 Bt蛋白改造高中生物学

组合蛋白质工程和代谢工程设计全细胞催化剂合成靛蓝和靛玉红

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生物工程学报 2016年第1期32卷 41-50页

作者：李阳朱俊歌王建军夏焕章吴胜沈阳药科大学生命科学和生物制药学院辽宁沈阳110016 中国科学院微生物研究所微生物资源前期开发国家重点实验室北京100101

从嗜高温放线菌Thermobifida fusca中分离得到的苯基丙酮单加氧酶主要催化芳香族化合物的Baeyer-Villiger氧化反应。对该酶的结构和功能进行研究时,发现位于底物结合口袋的Met446位点突变可以赋予突变酶催化C-H键活化的新功能,氧化吲哚... 详细信息

从嗜高温放线菌Thermobifida fusca中分离得到的苯基丙酮单加氧酶主要催化芳香族化合物的Baeyer-Villiger氧化反应。对该酶的结构和功能进行研究时,发现位于底物结合口袋的Met446位点突变可以赋予突变酶催化C-H键活化的新功能,氧化吲哚合成靛蓝和靛玉红,但产量仅为1.89 mg/L。为了获得合成靛蓝和靛玉红的全细胞催化剂,直接补加吲哚并不能提高细胞合成效率,补加吲哚的前体物质L-色氨酸可以使细胞合成靛蓝和靛玉红的能力提高4.5倍,达到8.43 mg/L。为了进一步提高细胞的生物合成效率,通过代谢工程改造大肠杆菌的糖代谢途径,阻断葡萄糖异构酶基因pgi,使磷酸戊糖途径代替糖酵解途径成为葡萄糖的主要代谢通路,从而为细胞提供更多氧化吲哚所需的辅因子NADPH,导致细胞合成靛蓝和靛玉红的效率进一步提高3倍,达到25 mg/L。通过组合蛋白质工程和代谢工程设计全细胞催化剂不仅可以高效地合成靛蓝和靛玉红,而且设计理念为相关全细胞催化剂的开发提供了一种新的策略。

关键词：靛蓝靛玉红苯基丙酮单加氧酶蛋白质工程代谢工程