蛋白质工程改造磷脂酶D提高磷脂酰丝氨酸产量

作     者：冯小娜 齐娜 宋伟 刘佳 刘立明 吴静 FENG Xiao-na;QI Na;SONG Wei;LIU Jia;LIU Li-ming;WU Jing

作者机构：江南大学药学院江苏无锡214122 江南大学食品科学与技术国家重点实验室江苏无锡214122 

出 版 物：《食品工业科技》 (Science and Technology of Food Industry)

年 卷 期：2020年第41卷第17期

页      面：98-103,108页

学科分类：08[工学] 0822[工学-轻工技术与工程] 082203[工学-发酵工程] 

基　　金：国家轻工技术与工程一流学科自主课题(LITE2018-20) 江苏省科技支撑计划社会发展项目(BE2018623)。 

主　　题：蛋白质工程 磷脂酶D 磷脂酰丝氨酸 催化通道 催化距离 定点突变 

摘      要：为了进一步提高磷脂酰丝氨酸(PS)产量,将来源于Streptomyces katrae的野生型磷脂酶D(SkPLD)于E.coli BL21(DE3)中进行异源表达,获得菌株E.coli BL21(DE3)/pET28a-SkPLD,以磷脂酰胆碱(PC)和L-serine为底物,发现限制PS产量进一步提高的限制因素是转磷脂酰反应转化率低(30%)。在对SKPLD结构进行详尽分析的基础上,通过蛋白质工程改造策略扩大底物催化通道,降低位阻效应;同时提高His462与L-serine的亲和力,降低水解反应。结果表明,获得4个有益单突变体(Y405A、Q407G、D370P、K478P),对其进行组合突变,获得四突变体SkPLDY405A/Q407G/D370P/K478P,转化率、PS产量、kcat/Km分别为55.6%、42.3 g·L-1、1.53 (mmol/L)-1s-1,比野生型分别提高了59.8%、59.6%、93.7%。PS产量进一步提高的原因在于四突变体催化腔体积扩大到718.6■3,且His462 N原子与L-serine O原子的催化距离(d1)缩短0.6■,与H2O O原子的距离(d2)增加0.8■。在3 L规模转化体系中,PS产量为50.4 g·L-1、转化率达到66.3%,时空产率为12.6 g/L/h。本研究利用蛋白质工程改造获得了转磷脂酰活性提高的突变体,为提高磷脂酶D的工业生产奠定了坚实的基础。