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菜籽肽的制备及活性研究

菜籽肽的制备及活性研究

作者：王紫燕吉林大学

学位级别：硕士

生物活性肽就是对生物机体的生命活动有益或是具有生理作用的肽类化合物,主要通过从天然物质中提取、酶解法、发酵法、化学合成法四种途径获得,其生理功能涉及机体的生长发育、新陈代谢、系统调节等多个环节,因此生物活性肽尤其是食源... 详细信息

生物活性肽就是对生物机体的生命活动有益或是具有生理作用的肽类化合物,主要通过从天然物质中提取、酶解法、发酵法、化学合成法四种途径获得,其生理功能涉及机体的生长发育、新陈代谢、系统调节等多个环节,因此生物活性肽尤其是食源性小分子肽已经成为国内外热门研究领域。菜籽饼粕作为油菜籽榨油后的副产物,其蛋白质含量丰富、氨基酸组成均衡,是一种优质的植物蛋白资源。目前对于菜籽蛋白的研究主要集中在饲料添加方面,本文主要是对菜籽蛋白的水解产物菜籽肽,进行体外抗氧化、皮肤保湿和皮肤抗炎等一系列研究。本文选取菜籽饼粕为原料利用酶法水解制备了菜籽肽,随后通过正交实验确定了酶解的最适条件,即称取10g菜籽饼粕,按照料液比1:10(m/m)加入高纯水,然后加入一定体积的碱性蛋白酶液反应60min,此条件下菜籽蛋白的水解度最高,为15.96%。通过对菜籽肽的理化性质分析可知,菜籽肽中蛋白质的含量为47.39%,经高效液相分析得知其分子量主要分布在2000 Da以下。对菜籽肽进行体外抗氧化研究发现,当菜籽肽浓度为1.25 mg/m L时,对ABTS自由基的清除率达到了98.02%,当菜籽肽浓度达到1 mg/m L时,对羟自由基的清除率达到了77.21%,对DPPH自由基的清除率达到了87.79%,抗氧化效果显著。为了进一步研究菜籽肽在细胞中的抗氧化效果,进行了人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的氧化损伤实验,结果表明,当菜籽肽浓度达到100 mg/m L和1 mg/m L时,氧化损伤细胞的存活率分别达到了86.84%和93.48%,表明菜籽肽在对人体正常细胞不产生毒副作用,同时能够修复HO对细胞造成的氧化损伤。紧接着本文又探究了菜籽肽对皮肤的作用效果。首先为了验证菜籽肽在人体皮肤表面的吸收情况,本文进行了透皮吸收实验,发现20 mg/m L的菜籽肽溶液的透皮吸收系数为0.4308,表明吸收性能良好。为了探究菜籽肽的保湿效果,本文分别在低湿和高湿两种湿度环境中,测定了菜籽肽的吸湿性和保湿性,结果表明菜籽肽在体外具有很好地保湿效果。随后又制备出理化性质稳定的菜籽肽膏霜,在人体皮肤上进行保湿效果评价,发现涂抹菜籽肽含量为2%的膏霜后,在相对湿度在20%以下的环境中,皮肤含水量可以达到36.46%,涂抹2 h后皮肤含水量依旧可以保持在27%以上,结果表明菜籽肽对人体皮肤有良好的保湿效果。随后进行了菜籽肽体外抗炎作用研究,通过检测脂多糖(LPS)诱导的小鼠单核巨噬细胞(RAW246.7)细胞炎症模型中白介素-6(IL-6)和肿瘤杀伤因子-α(TNF-α)两种促炎症因子的含量,探究菜籽肽在体外的细胞抗炎活性。随后通过建立小鼠耳廓肿胀模型,探究了菜籽肽膏霜对炎症皮肤的保护作用,发现当涂抹菜籽肽添加量为3%的膏霜时,小鼠耳廓肿胀度降低至70.79%,结果表明菜籽肽能够有效的减轻皮肤炎症。本文旨在通过对菜籽蛋白的酶解产物——菜籽肽的各项生理活性功能进行研究,提高菜籽蛋白或菜籽饼粕的附加经济价值,为进一步开发生物活性肽相关的化妆品制剂和医用皮肤保护剂,提供部分理论依据。

关键词：菜籽肽抗氧化性透皮吸收皮肤保湿抗炎

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超微耦合酶解制备菜籽肽的工艺及其活性研究

超微耦合酶解制备菜籽肽的工艺及其活性研究

作者：胡龙彪河北工程大学

学位级别：硕士

油菜籽是世界第三大植物油原料，副产物是菜籽饼粕，其为重要的植物蛋白质资源。目前大部分的菜籽饼粕主要作为畜禽饲料处理，附加值较低，没有得到合理高效的利用。酶解法作为肽的主要制备方法，需将原料中蛋白质提取出来再进行反应，... 详细信息

油菜籽是世界第三大植物油原料，副产物是菜籽饼粕，其为重要的植物蛋白质资源。目前大部分的菜籽饼粕主要作为畜禽饲料处理，附加值较低，没有得到合理高效的利用。酶解法作为肽的主要制备方法，需将原料中蛋白质提取出来再进行反应，反应过程复杂且酸碱消耗量大。而超微粉碎可以提高物料中组分的析出。所以本研究以菜籽饼粕为原料，利用超微粉碎进行前处理，使用蛋白酶直接作用于菜籽饼粕超微粉，通过单因素试验以及响应面试验对菜籽肽的制备工艺进行优化。采用膜分离技术及柱层析技术对制备的菜籽肽进行分离纯化，探究其抗氧化能力、血管紧张素转化酶-Ⅰ（ACE）抑制能力、乙醇脱氢酶（ADH）激活能力，并对活性较强的组分进行液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）氨基酸序列分析。　　具体研究结果如下：　　1.超微粉碎能显著降低菜籽饼粕粒径，其超微粉碎 40min 组 D50（粒径中值）显著降低，比表面积随粒径减小而增大，比表面积显著增高。随着粒径的减小，其L*值变大，a*、b*变大，亮度增加而色泽变淡。与普通粉碎60目组相比，超微粉的吸附能力显著降低。蛋白质及膳食纤维总量并无显著变化，可溶性膳食纤维出现升高现象，在超微粉碎30min时可溶性膳食纤维含量最高。与普通粉碎60目相比，超微粉蛋白质溶出率显著提高，超微粉碎 30min 组溶出率最高为 34%，较对照组提高了7%，因此选择超微粉碎30min组进行下一步试验。　　2.根据蛋白质溶出率的测定结果，以超微粉碎30min的菜籽饼粕为原料，使用碱性蛋白酶和风味蛋白酶（主要有氨肽酶和羧肽酶）分别进行酶解，通过单因素试验和响应面试验进行工艺优化，得到最佳工艺为：碱性蛋白酶技术：加酶量5100U/g、pH9.4、时间 3.05h ，该条件下多肽得率为 76.09%±4.09%，水解度29.31±1.14%。风味蛋白酶技术：加酶量 6300U/g、pH2.95、时间 2.26h ，该条件下多肽得率为83.28%±2.43%，水解度39.22±3.14%。　　3.综合抗氧化指标测定结果，碱性蛋白酶酶解产物的抗氧化能力和自由基清除能力均优于风味蛋白酶酶解产物。膜分离组分结果显示，＜1kDa 分子量范围抗氧化能力最佳。层析柱组分结果显示，碱性蛋白酶J2组分抗氧化能力最高，总抗氧化能力（T-AOC）为1193.58±28.71μmol/g，ABTS自由基清除能力为89.62±0.45%， DPPH 自由基清除能力为 17.39±0.46%。风味蛋白酶 F2 组分抗氧化能力最高，总抗氧化能力（T-AOC）为764.95±44.71μmol/g，ABTS自由基清除能力为71.62±0.23%， DPPH自由基清除能力为8.30±0.50%　　4.两种酶解肽均呈现出较强的ACE抑制能力和ADH酶激活能力。对于ACE抑制能力，风味蛋白酶ACE抑制能力要优于碱性蛋白酶，＜1kDa分子量范围ACE能力最强。而 ADH 酶激活能力风味蛋白酶 3k-5kDa 范围内活性最强，为195.34±1.35%。碱性蛋白酶 1k-3kDa 范围内活性最佳为，略小于风味蛋白酶154.24±2.35%。氨基酸序列分析表明两组分均为混合肽段，筛选占比在 0.5%以上的肽段共得到59条，其中J2组分中鉴定到占比0.5%以上的肽段17条，F2组分中鉴定到占比0.5%以上的肽段42条。对两组分二肽序列二级质谱结构鉴定分别为J2: IL、IQ、PF、RF、VF;F2: IE、IL、PF、SF、TF。

关键词：菜籽肽菜籽饼粕超微粉碎蛋白酶解抗氧化能力

饲粮添加菜籽肽对断奶仔猪生长性能、抗氧化力、免疫力和肠道微生物区系的影响

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饲粮添加菜籽肽对断奶仔猪生长性能、抗氧化力、免疫力和肠道微生...

作者：林培文西南大学

学位级别：硕士

菜籽肽(Rapeseed peptides,RSP)是菜籽蛋白水解后得到的一组具有一定生物活性功能的肽类混合物,其分子量小、氨基酸组成均衡且含量丰富、易于吸收的特点决定了其具有较高的应用价值。本文研究了在饲粮中添加菜籽肽对断奶仔猪的生长性能... 详细信息

菜籽肽(Rapeseed peptides,RSP)是菜籽蛋白水解后得到的一组具有一定生物活性功能的肽类混合物,其分子量小、氨基酸组成均衡且含量丰富、易于吸收的特点决定了其具有较高的应用价值。本文研究了在饲粮中添加菜籽肽对断奶仔猪的生长性能、腹泻率、养分表观消化率、养分代谢相关指标、抗氧化力和免疫力等的影响,拟探讨菜籽肽的应用效果和作用机理,为菜籽肽作为植物蛋白原料在断奶仔猪的应用上积累更多的数据。试验包括两部分:试验一,进行体外试验,并以DPPH、ATBS自由基清除率为指标,测定菜籽肽的体外抗氧化活性。试验二,进行动物饲养试验,随机选取60只健康且体重为9.38±0.18 kg的33-35日龄DLY断奶仔猪,分为3个组,每组5个重复且每个重复4头猪,设置基础饲粮,添加1%菜籽肽(在基础饲粮上以1%菜籽肽等氮等能替代),2%菜籽肽的饲粮(在基础饲粮上以2%菜籽肽等氮等能替代);预饲5d,正式试验28天,按常规程序对试验仔猪进行饲养和管理,饲喂颗粒饲粮,自由采食和饮水,并以常规方法免疫消毒。每天在08:00、12:30和18:00时进行饲喂,每天上午7:00和下午3:00分别观察并记录猪只腹泻情况。分别在第0天、15天、29称重及记录饲料消耗量,在第28天采集粪样以测定表观消化率和微生物组成及相对丰度等;在试验的第29天,对各处理组随机选取的5只猪进行前腔静脉采血,采血称重前禁食24h。结果表明:(1)在菜籽肽质量浓度为0.25mg/m L时,对DPPH自由基的清除率为74%;在浓度为0.30mg/m L时,对ATBS自由基清除率为93%。表明菜籽肽在体外能发挥良好的清除自由基的功效,具有较高的抗氧化能力。(2)与对照组相比,饲粮添加1%和2%菜籽肽对断奶仔猪的BW、F/G和ADFI无显着影响(P>0.05),但均能显著提高断奶仔猪的日增重(0.01菜籽肽均能显著降低断奶仔猪的腹泻率和腹泻指数(0.01菜籽肽组效果更佳;与对照组相比,饲粮添加1%和2%菜籽肽对饲粮粗脂肪、总磷和有机物的表观消化率无显著影响(P>0.05),但添加2%的菜籽肽可以显著提高饲粮总能、粗蛋白质和钙的表观消化率(0.01菜籽肽对断奶仔猪血细胞相关指标无显著影响(P>0.05);与对照组相比,饲粮中添加1%和2%菜籽肽均能显著提高断奶仔猪血清白蛋白含量(0.01菜籽肽可以显著提高血清高密度脂蛋白含量;与对照组相比,饲粮中添加1%和2%菜籽肽对血清Ig M、Ig G、IL-2、IL-6、IL-8和TNF-α含量均无显著影响(P>0.05),但均能显著提高断奶仔猪Ig A含量(0.01菜籽肽对血清T-SOD活力、T-AOC和MDA含量均无显著影响(P>0.05),添加1%的菜籽肽可以显著提高GSH-Px活力和CAT活力(0.01菜籽肽也可以显著提高CAT活力(0.01菜籽肽对断奶仔猪粪便中总菌数、大肠杆菌数、酵母菌数、双歧杆菌数、乳酸菌数均无显着影响(P>0.05),但乳酸菌的数量有增加的趋势(0.05菜籽肽可以显著提高断奶仔猪粪便中有益菌乳杆菌属相对丰度(0.01菜籽肽可以显著降低有害菌属粪杆菌真核菌群、密螺旋体属-2和粪球菌属-1的相对丰度,并能显著提高粪便菌群的多样性(0.01菜籽肽在体外具有较高的抗氧化活性;在饲粮中添加菜籽肽能提高断奶仔猪生长性能,降低腹泻率,提高表观消化率,增加血清中蛋白含量。同时菜籽肽有助于改善仔猪的抗氧化能力;提高Ig A含量,增强断奶仔猪的免疫力。粪便中有益菌群乳杆菌属相对丰度和数量的增加,表明菜籽肽对断奶仔猪的肠道健康也产生了积极影响。

关键词：菜籽肽断奶仔猪生长性能抗氧化力免疫力肠道健康

菜籽肽小分子RPH-P4对超负荷运动后心肌损伤和氧化应激的影响

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分子植物育种 2023年第13期21卷 4375-4381页

作者：安俊智郑州西亚斯学院郑州451150

通过对菜籽蛋白酶解物(RPH)进行超滤分离的菜籽肽具有良好的抗氧化活性,其中分子质量<3 kD的菜籽肽小分子(RPH-P4)的抗氧化活性最好。本研究旨在考察RPH-P4对超负荷运动(OE)诱导的大鼠心肌损伤和氧化应激的影响。研究结果表明,与OE组比... 详细信息

通过对菜籽蛋白酶解物(RPH)进行超滤分离的菜籽肽具有良好的抗氧化活性,其中分子质量菜籽肽小分子(RPH-P4)的抗氧化活性最好。本研究旨在考察RPH-P4对超负荷运动(OE)诱导的大鼠心肌损伤和氧化应激的影响。研究结果表明,与OE组比较,OE+500-RPH-P4组、OE+1000-RPH-P4组和OE+1500-RPH-P4组的LVPWd、LVPWs和LVIDs降低,EF和FS升高,血清LDH、CK和cTnI水平降低,心肌形态明显改善(P<0.05)。与OE组比较,OE+500-RPH-P4组、OE+1000-RPH-P4组和OE+1500-RPH-P4组的心肌组织SOD和CAT升高,MDA降低(P<0.05)。与OE组比较,OE+500-RPH-P4组、OE+1000-RPH-P4组和OE+1500-RPH-P4组的心肌组织Nrf2和HO-1 mRNA和蛋白相对表达量升高,Keap1 mRNA和蛋白相对表达量降低(P<0.05)。RPH-P4有效减轻了超负荷运动诱导的大鼠心肌损伤并抑制了氧化应激,其机制可能与Nrf2/Keap1/HO-1信号通路的激活有关。

关键词：菜籽肽小分子RPH-P4 菜籽蛋白酶解物氧化应激超负荷运动

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菜籽肽的酶法制备及其抗凝血活性研究

菜籽肽的酶法制备及其抗凝血活性研究

作者：王子伟河南工业大学

学位级别：硕士

油菜是世界第二大油料作物，其菜籽蛋白为完全蛋白质，必需氨基酸平衡性强，是适合人类食用的优质蛋白质。本文以冷榨菜籽饼为原料，制备菜籽蛋白，并进一步通过酶法制备菜籽肽，研究了菜籽肽的抗凝血活性;通过大孔吸附树脂和活性炭对... 详细信息

油菜是世界第二大油料作物，其菜籽蛋白为完全蛋白质，必需氨基酸平衡性强，是适合人类食用的优质蛋白质。本文以冷榨菜籽饼为原料，制备菜籽蛋白，并进一步通过酶法制备菜籽肽，研究了菜籽肽的抗凝血活性;通过大孔吸附树脂和活性炭对酶解液进行脱盐、脱色精制，并研究不同菜籽肽产品的氨基酸组成、相对分子质量分布和抗凝血活性;通过SephadexG-15过滤色谱、半制备RP-HPLC和SEC-HPLC分离制备具有高抗凝活性的菜籽肽。通过正交试验确定了碱提菜籽蛋白的最佳工艺条件：料液比（g/mL）1:15、pH为12、温度55℃、提取时间80min。在此条件下，蛋白质的提取率达到88.5%。在pH4.5的条件下酸沉蛋白提取液，真空冷冻干燥后，得到蛋白质含量为85.1%的菜籽蛋白。通过酶种筛选，确定使用Alcalase2.4L酶解菜籽蛋白;通过单因素试验确定了其最佳酶解工艺条件：底物浓度3.0g/100mL，加酶量为7000U/(g蛋白)，反应温度60℃，pH8.5，酶解时间2h。在此条件下酶解液的凝血酶抑制率可达到98.8%，菜籽酶解液的水解度为18.1%。 pH对菜籽蛋白酶解液的色泽有较大的影响。通过比较，发现在酸性条件下（pH2.5）粉末活性炭的脱色效果优于颗粒活性炭，但是，肽损失率要高于颗粒活性炭。随着粉末活性炭添加量的增多，脱色效果越来越好，同时肽损失率也迅速增加。综合考虑脱色效果和肽损失率，粉末活性炭的添加量确定为3%。通过粉末活性炭脱色和DA201-C大孔吸附树脂脱盐后分别得到的脱色肽（蛋白质含量为68.9%）和脱盐肽（蛋白质含量为90.3%）。脱色肽中疏水性氨基酸损失较多，而脱盐肽中部分疏水性氨基酸的相对含量得到提高。其相对分子质量低于1000的组分所占的比例均有下降。通过酶标仪法测定菜籽肽的凝血酶抑制率，分别得到菜籽粗肽、树脂脱盐肽和粉末活性炭脱色肽的半数抑制率IC50为16.5mg/mL、74.4mg/mL和52.5mg/mL。用SephadexG-15分离菜籽肽，上样量100mg、流速150mL/h时菜籽肽分离效果最好。同时，收集得到4个主要组分，其中G1组分浓度为1mg/mL时，对凝血酶的抑制率达到96.8%。用半制备RP-HPLC分离G1组分，确定最佳洗脱条件为：0～5min l00～80%A;5～20min80～60%A;20～25min60～0%A;25～27min0%A;27～29min0～100%A;29～40min100%A（A：5%乙腈，含0.1%TFA;B：80%乙腈，含0.1%TFA），流动相的流速1.5mL/min。在此条件下得到8个主要组分，其中G1-R8的抗凝血效果最好，在0.41mg/mL时，可以完全抑制凝血酶的活性。使用SEC-HPLC进一步分离G1-R8，结果表明G1-R8仍不是单一组分。

关键词：酶法菜籽肽抗凝血凝血酶活性纯化

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菜籽肽的制备分离和化学修饰研究进展

中国油脂 2008年第12期33卷 32-35页

作者：鞠兴荣何荣袁建顾建洪南京财经大学食品科学与工程学院江苏省粮油品质控制及深加工技术重点实验室南京210003 南通宏通生物科技有限公司江苏南通226006

菜籽肽具有独特的加工特性和生物活性。综述了菜籽肽的制备方法、分离技术、化学修饰和菜籽蛋白水解液中小肽氨基酸组成测定方法的研究进展,指出了菜籽肽生产工艺中存在的问题,提出了发酵法生产菜籽肽的新思路,对菜籽肽的应用前景进行... 详细信息

菜籽肽具有独特的加工特性和生物活性。综述了菜籽肽的制备方法、分离技术、化学修饰和菜籽蛋白水解液中小肽氨基酸组成测定方法的研究进展,指出了菜籽肽生产工艺中存在的问题,提出了发酵法生产菜籽肽的新思路,对菜籽肽的应用前景进行了展望。

关键词：菜籽肽制备分离化学修饰发酵

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菜籽肽抑制肿瘤作用和对免疫功能的影响

中国粮油学报 2007年第1期22卷 73-75页

作者：薛照辉尉万聪吴谋成刘春泉天津大学农业与生物工程学院天津300072 清华大学生物科学与技术系北京100084 华中农业大学食品科技学院武汉430070 江苏省农业科学院南京210014

以小鼠S180实体瘤模型为研究对象,通过观察小鼠的肿瘤重量、淋巴细胞转化能力、脾细胞抗体形成及血清溶血素含量的变化。研究了菜籽清蛋白经酶水解产生菜籽肽(RSP)抑制小鼠体内S180肉瘤的生长和对小鼠免疫功能的影响。结果表明,与环磷... 详细信息

以小鼠S180实体瘤模型为研究对象,通过观察小鼠的肿瘤重量、淋巴细胞转化能力、脾细胞抗体形成及血清溶血素含量的变化。研究了菜籽清蛋白经酶水解产生菜籽肽(RSP)抑制小鼠体内S180肉瘤的生长和对小鼠免疫功能的影响。结果表明,与环磷酰胺比,菜籽肽对S180肉瘤生长有抑制作用,同时明显增强小鼠免疫能力。

关键词：菜籽肽 S180肉瘤肿瘤抑制免疫功能

菜籽肽的制备及其对大鼠血管紧张素Ⅰ转换酶(ACE)活性的影响(英文)

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食品科学 2007年第2期28卷 289-292页

作者：薛照辉尉万聪吴谋成周志江刘春泉天津大学农业与生物工程学院天津300072 中国农业科学院生物技术研究所北京100081 华中农业大学食品科技学院湖北武汉430070 江苏省农业科学院江苏南京210014

目的:分离菜籽清蛋白水解物并研究混合肽及级分对大鼠血管紧张素Ⅰ转换酶(ACE)活性的影响。方法:采用葡聚糖凝胶过滤色谱(SephadexG-25)分离菜籽肽;离体培养检测血管紧张素Ⅰ转换酶(ACE)活性。结果:菜籽肽(RSP-R)及分离的三个级分(RSP-... 详细信息

目的:分离菜籽清蛋白水解物并研究混合肽及级分对大鼠血管紧张素Ⅰ转换酶(ACE)活性的影响。方法:采用葡聚糖凝胶过滤色谱(SephadexG-25)分离菜籽肽;离体培养检测血管紧张素Ⅰ转换酶(ACE)活性。结果:菜籽肽(RSP-R)及分离的三个级分(RSP-Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ)对高血压大鼠ACE活性均有明显抑制作用,其中级分Ⅲ抑制能力最强。结论:菜籽清蛋白水解多肽具有抑制ACE活性能力,这一结果有助于菜籽清蛋白的广泛应用。

关键词：菜籽清蛋白菜籽肽血管紧张素转换酶(ACE)抑制因子洛汀新生物活性肽

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菜籽肽抗氧化活性的研究

中国油脂 2006年第8期31卷 48-50页

作者：薛照辉尉万聪严奉伟吴谋成周志江天津大学农业与生物工程学院天津市300072 中国农业科学院生物技术研究所北京市100081 华中农业大学食品科技学院武汉市430072

用分光光度法测定大鼠红细胞溶血程度,用丙二醛(MDA)试剂盒测定MDA。结果显示,通过腹膜注射菜籽肽,可以使小鼠血清中MDA含量显著减少。高剂量组[100 mg/(kg.d)]与对照组相比,MDA的降低达到极显著水平(P<0.01)。离体实验结果显示,菜籽肽... 详细信息

用分光光度法测定大鼠红细胞溶血程度,用丙二醛(MDA)试剂盒测定MDA。结果显示,通过腹膜注射菜籽肽,可以使小鼠血清中MDA含量显著减少。高剂量组[100 mg/(kg.d)]与对照组相比,MDA的降低达到极显著水平(P菜籽肽粗品及各级分对体外温育和H2O2诱导的小鼠肝组织匀浆MDA生成有较强的抑制作用,其中粗品RSP-R和级分RSP-1的作用最好,且有量效关系,而对Fe2+诱导的MDA生成的抑制作用稍差。另外,RSP-R还可抑制大鼠红细胞氧化溶血程度。以上结果表明,菜籽肽在体内外均具有明显的抗氧化作用。

关键词：菜籽清蛋白菜籽肽抗氧化体内体外