菜籽肽的酶法制备及其抗凝血活性研究

作     者：王子伟 

作者单位：河南工业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陆启玉;章绍兵

授予年度：2014年

学科分类：0832[工学-食品科学与工程（可授工学、农学学位）] 08[工学] 083202[工学-粮食、油脂及植物蛋白工程] 

主      题：酶法 菜籽肽 抗凝血 凝血酶 活性 纯化 

摘      要：油菜是世界第二大油料作物，其菜籽蛋白为完全蛋白质，必需氨基酸平衡性强，是适合人类食用的优质蛋白质。本文以冷榨菜籽饼为原料，制备菜籽蛋白，并进一步通过酶法制备菜籽肽，研究了菜籽肽的抗凝血活性;通过大孔吸附树脂和活性炭对酶解液进行脱盐、脱色精制，并研究不同菜籽肽产品的氨基酸组成、相对分子质量分布和抗凝血活性;通过SephadexG-15过滤色谱、半制备RP-HPLC和SEC-HPLC分离制备具有高抗凝活性的菜籽肽。 通过正交试验确定了碱提菜籽蛋白的最佳工艺条件：料液比（g/mL）1:15、pH为12、温度55℃、提取时间80min。在此条件下，蛋白质的提取率达到88.5%。在pH4.5的条件下酸沉蛋白提取液，真空冷冻干燥后，得到蛋白质含量为85.1%的菜籽蛋白。 通过酶种筛选，确定使用Alcalase2.4L酶解菜籽蛋白;通过单因素试验确定了其最佳酶解工艺条件：底物浓度3.0g/100mL，加酶量为7000U/(g蛋白)，反应温度60℃，pH8.5，酶解时间2h。在此条件下酶解液的凝血酶抑制率可达到98.8%，菜籽酶解液的水解度为18.1%。 pH对菜籽蛋白酶解液的色泽有较大的影响。通过比较，发现在酸性条件下（pH2.5）粉末活性炭的脱色效果优于颗粒活性炭，但是，肽损失率要高于颗粒活性炭。随着粉末活性炭添加量的增多，脱色效果越来越好，同时肽损失率也迅速增加。综合考虑脱色效果和肽损失率，粉末活性炭的添加量确定为3%。 通过粉末活性炭脱色和DA201-C大孔吸附树脂脱盐后分别得到的脱色肽（蛋白质含量为68.9%）和脱盐肽（蛋白质含量为90.3%）。脱色肽中疏水性氨基酸损失较多，而脱盐肽中部分疏水性氨基酸的相对含量得到提高。其相对分子质量低于1000的组分所占的比例均有下降。 通过酶标仪法测定菜籽肽的凝血酶抑制率，分别得到菜籽粗肽、树脂脱盐肽和粉末活性炭脱色肽的半数抑制率IC50为16.5mg/mL、74.4mg/mL和52.5mg/mL。用SephadexG-15分离菜籽肽，上样量100mg、流速150mL/h时菜籽肽分离效果最好。同时，收集得到4个主要组分，其中G1组分浓度为1mg/mL时，对凝血酶的抑制率达到96.8%。 用半制备RP-HPLC分离G1组分，确定最佳洗脱条件为：0～5min l00～80%A;5～20min80～60%A;20～25min60～0%A;25～27min0%A;27～29min0～100%A;29～40min100%A（A：5%乙腈，含0.1%TFA;B：80%乙腈，含0.1%TFA），流动相的流速1.5mL/min。在此条件下得到8个主要组分，其中G1-R8的抗凝血效果最好，在0.41mg/mL时，可以完全抑制凝血酶的活性。使用SEC-HPLC进一步分离G1-R8，结果表明G1-R8仍不是单一组分。