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ALA促进苹果愈伤组织花青苷及黄酮醇积累的机理研究

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ALA促进苹果愈伤组织花青苷及黄酮醇积累的机理研究

作者：陶慧慧南京农业大学

学位级别：硕士

花青苷,作为果实色泽的重要组成,它能影响果实外观品质,从而影响消费者的购买行为及产品的商业价值。同样,黄酮醇作为类黄酮的重要成员,在植物抵抗逆境、色泽发育、调节植物生长发育等方面也发挥积极作用。5-氨基乙酰丙酸(ALA)是一种新... 详细信息

花青苷,作为果实色泽的重要组成,它能影响果实外观品质,从而影响消费者的购买行为及产品的商业价值。同样,黄酮醇作为类黄酮的重要成员,在植物抵抗逆境、色泽发育、调节植物生长发育等方面也发挥积极作用。5-氨基乙酰丙酸(ALA)是一种新型植物生长调节剂,业已证明,其不仅能促进苹果果皮花青苷积累,刺激果实着色;同时它也能促进苹果黄酮醇的积累,清除活性氧,调节叶片气孔运动,提高植物抗逆性。但目前关于ALA调控苹果花青苷和黄酮醇的生物合成机理还未阐明。因此,本实验以‘富士’苹果(Malus × domenstica Borkh cv.Fuji)愈伤组织为材料。一方面研究了参与ALA诱导苹果果实着色的转录因子MdMADS1与花青苷结构基因启动子之间的相互作用。另一方面,确定了 ALA对黄酮醇生物合成的积极影响,并揭示了苹果黄酮醇生物合成调控新机制。其取得的主要结果如下。1.本实验室已证实转录因子MdMADS1在ALA促进苹果果皮着色中发挥重要作用。为阐明MdMADS1蛋白的作用机制,本文利用酵母单杂交技术研究了 MdMADS1与苹果花青苷合成关键酶基因MdCHS、MdDFR、MdLDOX、MdUFGT启动子的结合效应。诱饵序列选取的是上述基因启动子序列中的CArG序列5’-CC(A/T)6GG-3’、N10-like 序列 5’-CTA(A/T)4TAG-3’和 CARGCW8GAT 序列 5’-C(A/T)8G-3’。研究发现,MdMADS1能与MdCHS和MdUFGT启动子区域的N10-like序列结合,与CArG序列无明确互作关系。随后,就MdUFGT启动子序列中的N10-like序列设计了 3个突变序列,针对这些突变序列,酵母单杂交结果表明,苹果MdMADS1所结合的DNA位点是N10-like序列中的5’-CTATAG-3’。另外,本文还利用双荧光素酶实验进步证实了苹果MdMADS 1能上调MdCHS和MdUFGT基因的表达。2.为阐明ALA促进黄酮醇积累的调控机制,我们对本实验室前期转录组数据进行分析,结果表明,有5个MdFLSs基因受ALA的显著诱导。随后,根据序列比对分析结果,选取了 MdFLS1基因启动子,并对其进行了克隆及序列分析。通过构建pMdFLS1::GUS启动子表达载体,瞬时转化至‘富士’苹果愈伤,发现ALA对MdFLS1启动子活性具有增强效应。这表明ALA信号会影响苹果黄酮醇合成关键酶基因MdFLS1启动子的表达活性,促进基因表达,诱导黄酮醇积累。3.为进步揭示苹果黄酮醇生物合成调控机制。我们首先建立了苹果愈伤组织的cDNA文库。然后以MdFLS1启动子序列为诱饵序列,获得诱饵酵母。在苹果愈伤组织cDNA文库中利用酵母单杂交技术筛选得到135个阳性克隆。经酵母菌落PCR及测序分析,去除假阳性和管家基因,获得23个能与MdFLS1启动子互作的蛋白。其中包含一个转录因子MdSCL8,并对其进行了生物信息学分析及功能域预测。最后,qRT-PCR实验同样也证实,ALA处理能上调MdFLS1和MdSCL8的表达。以上结果为探究ALA调控花青苷及黄酮醇合成的分子机制开拓了新视野,同时也为ALA提高苹果果实着色及增强植物抗逆性研究提供一定的理论基础。

关键词： ALA 花青苷黄酮醇酵母单杂交 MdFLS1 MdMADS1 苹果cDNA文库苹果愈伤启动子

光诱导基因MdBBX21促进苹果果皮花青苷合成机制研究

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光诱导基因MdBBX21促进苹果果皮花青苷合成机制研究

作者：朱珍珍西北农林科技大学

学位级别：硕士

苹果(Malus domestica Borkh.)果皮的色泽对其营养价值和经济价值具有十分重要的影响。果皮的红色是由花青苷的含量和种类决定的,光照是花青苷合成过程不可或缺的环境因素。在光照条件下,苹果果皮中花青苷含量积累,与花青苷合成相关的... 详细信息

苹果(Malus domestica Borkh.)果皮的色泽对其营养价值和经济价值具有十分重要的影响。果皮的红色是由花青苷的含量和种类决定的,光照是花青苷合成过程不可或缺的环境因素。在光照条件下,苹果果皮中花青苷含量积累,与花青苷合成相关的基因表达量上调,然而光诱导上述基因的表达机制仍然不够清楚。本研究以红色苹果品种‘新红星’为材料,对光诱导果皮着色过程进行分析,寻找出差异表达的基因并对基因表达模式和功能进行分析,进一步阐明光信号传递机制在果皮花青苷合成中的作用,促进光诱导果实着色的分子机理的理解,为果实品质改良提供理论依据。本研究获得的主要结果如下:1.取白光照射后0 h(G0)、6 h(G6)、24 h(G24)的果皮进行高通量测序,将差异基因的表达量相对G0进行归一化,结果显示4082个差异基因被归类到两个显著上调模式(profile6和profile7)和一个显著下调模式(profile0)中。对上调模式和下调模式的差异基因进行KEGG富集分析,结果显示在上调模式中类黄酮生物合成(Flavonoid biosynthesis)和苯丙烷生物合成(Phenylpropanoid biosynthesis)相关基因显著富集。2.在显著上调模式profile6中鉴定了一个差异表达的基因MD08G1021000,将其命名为Md BBX21。基因表达分析结果表明,在‘新红星’果皮中Md BBX21表达量在光照3 h开始上调,并在9 h达到高峰,其表达量变化早于花青苷合成相关的结构基因和表达基因,说明Md BBX21能够快速受光诱导,可能在花青苷合成相关基因的上游发挥作用。3.对Md BBX21进行亚细胞定位分析,结果表明Md BBX21定位在细胞核中。在拟南芥上异源表达Md BBX21,转基因过表达拟南芥下胚轴和子叶中花青苷积累量增加,说明Md BBX21能够促进花青苷的生物合成。4.酵母双杂交和双分子荧光互补(Bi FC)试验证明Md BBX21与Md HY5分别在酵母细胞和活体植物细胞内互作。5.利用双荧光素酶系统检测Md BBX21对Md MYB10启动子的作用。结果显示,Md BBX21能够提高Md MYB10启动子的转录活性,但Md BBX21-p Green II 62-SK与Md HY5-p Green II 62-SK以及Pro MYB10-LUC质粒混合瞬时转化烟草叶片时,荧光素酶活性显著提高,说明Md BBX21能够与Md HY5蛋白互作后共同提高Md MYB10启动子的转录活性。

关键词：苹果(Malus domestica Borkh.) 花青苷 B-box蛋白(BBX) 光照

亚硒酸钠通过蔗糖调控萝卜（Raphanus sativus L.）芽菜下胚轴花青苷合成中的作用机理

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亚硒酸钠通过蔗糖调控萝卜（Raphanus sativus L.）芽菜下胚轴花...

作者：陈慧南京农业大学

学位级别：硕士

近年来研究表明,适量的硒处理不仅可以促进植物的生长发育,而且还能提高植物的营养品质和次生代谢物。亚硒酸钠是最常用的外源硒肥处理。有研究报道,外源添加适宜的亚硒酸钠可以促进植物花青苷含量的积累。此外,外源糖处理能提高植物花... 详细信息

近年来研究表明,适量的硒处理不仅可以促进植物的生长发育,而且还能提高植物的营养品质和次生代谢物。亚硒酸钠是最常用的外源硒肥处理。有研究报道,外源添加适宜的亚硒酸钠可以促进植物花青苷含量的积累。此外,外源糖处理能提高植物花青苷含量。但是目前就蔗糖是否参与亚硒酸钠诱导下花青苷合成的机理研究还比较少。‘扬花萝卜’属于十字花科植物具有较强的富硒能力,并且其成熟的果实表皮和芽苗期下胚轴富含丰富的花青苷。因此,本研究选择生长周期短的萝卜芽菜作为试验材料,通过外源添加亚硒酸钠探究其对萝卜芽菜下胚轴花青苷的影响,以及蔗糖在其中的作用。取得了以下主要结果:1.探究不同处理时间下外源添加亚硒酸钠对萝卜芽菜下胚轴花青苷合成的影响。结果表明10 μM亚硒酸钠水培萝卜芽菜,不会影响其正常生长和营养品质,且下胚轴中花青苷含量显著提高53%。此外,H2O2含量和抗氧化酶活性测定结果表明亚硒酸钠促进花青苷含量的增加不是由胁迫所致。ICP-MS检测结果表明,亚硒酸钠提高下胚轴中花青苷的含量不是直接由下胚轴内源总硒的变化所引起。RT-PCR试验结果揭示,与花青苷合成相关的结构基因PAL、CHI、CHS、ANS和UFGT的表达量在亚硒酸钠处理下均被显著上调。此外,外源添加亚硒酸钠可显著增加下胚轴蔗糖的含量,且蔗糖含量和花青苷的积累呈现正相关。综上结果表明,亚硒酸钠处理有效地提高萝卜芽菜下胚轴中花青苷的合成,从而促进下胚轴中花青苷含量的积累。且蔗糖可能在此过程中发挥重要作用。2.探究蔗糖在亚硒酸钠诱导下萝卜芽菜下胚轴花青苷合成的作用机理。不同部位中总硒含量试验表明亚硒酸钠处理显著提高下胚轴的花青苷含量可能与子叶中总硒的变化有关。叶绿素荧光动力学参数结果显示亚硒酸钠处理显著增强子叶的光合作用,且子叶遮光后亚硒酸钠诱导的下胚轴中花青苷含量被显著降低,表明光合作用在此过程中发挥重要作用。不同部位蔗糖含量测定和蔗糖转运体相对基因表达量结果揭示,亚硒酸钠处理显著提高下胚轴中蔗糖含量,并且提高了蔗糖从子叶向下胚轴中的转运。同时药理学试验结果揭示外源添加0.5μM DCMU抑制剂可显著降低萝卜芽菜下胚轴中花青苷和蔗糖含量,而亚硒酸钠和DCMU共处理时可显著缓解这种抑制效果。况且5 mM甘露醇处理的花青苷含量显著低于5 mM蔗糖处理,表明外源蔗糖提高下胚轴内源花青苷含量不是由渗透胁迫所致。综上表明,亚硒酸钠促进萝卜芽菜下胚轴花青苷的合成主要是通过提高子叶的光合作用,将更多的光合产物转移至下胚轴中。下胚轴中蔗糖含量的积累导致花青苷晚期合成结构基因的上调,最终促进了下胚轴花青苷含量的增加。

关键词：萝卜芽菜亚硒酸钠花青苷蔗糖

紫外光对‘北陆’越橘转色果花青苷积累、关键酶活性及其基因表达的影响

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园艺学报 2016年第4期43卷 663-673页

作者：杨俊枫史文君杨乐宫中志李彬彬侯智霞北京林业大学省部共建森林培育与保护教育部重点实验室蓝莓研究与发展中心北京100083

以3年生‘北陆’越橘为试材,对发育过程中果实花青苷含量及合成酶活性变化进行研究,并进一步利用3种紫外光(UV-A、UV-B、UV-C)分别照射转色期越橘果实,测定了果实中花青苷等酚类物质的含量、生物合成酶活性及其基因表达,从底物、酶活性... 详细信息

以3年生‘北陆’越橘为试材,对发育过程中果实花青苷含量及合成酶活性变化进行研究,并进一步利用3种紫外光(UV-A、UV-B、UV-C)分别照射转色期越橘果实,测定了果实中花青苷等酚类物质的含量、生物合成酶活性及其基因表达,从底物、酶活性、基因转录水平阐明了不同紫外光对花青苷生物合成途径的影响。3种紫外光都明显诱导了果实花青苷的积累,特别是UV-C照射后果实花青苷含量提高了2.36倍。UV照射显著诱导果实PAL、UFGT酶活性升高,VcPAL、VcUFGT转录增强,但同时也抑制了DFR酶活性及基因表达,其中PAL、UFGT酶活性与花青苷的积累极显著正相关(r=0.807**,r=0.894**),而DFR酶则相反(r=–0.854**)。结果表明,UV照射能诱导丙苯氨酸途径中响应紫外处理的一些关键基因的转录激活(如VcPAL,VcUFGT)或抑制(如VcDFR),并影响相应酶活性的变化,促使花青苷等酚类物质的积累。

关键词：越橘转色期果实紫外光花青苷酚类物质酶活性基因表达

浆果类水果中花青苷高效液相色谱测定方法的建立

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农产品质量与安全 2024年第3期 25-31,40页

作者：付红蕾王堃宇万浩亮张佳姜鹏刘晓丽韩令喜李倩魏亦山聂继云青岛农业大学园艺学院农业农村部果品质量安全风险评估实验室(青岛)青岛市现代农业质量与安全工程重点实验室山东青岛266109 青岛市农产品质量安全中心山东青岛266035 江苏省徐淮地区徐州农业科学研究所江苏徐州221131

建立了高效液相色谱法测定浆果类水果中矮牵牛素-3-O-葡萄糖苷等16种花青苷的方法。浆果类水果中的花青苷经盐酸甲醇溶液振荡提取,C18色谱柱分离,二极管阵列检测器检测,以保留时间定性,外标法定量。结果表明,花青苷在0.5~50 mg/L(矮牵牛... 详细信息

建立了高效液相色谱法测定浆果类水果中矮牵牛素-3-O-葡萄糖苷等16种花青苷的方法。浆果类水果中的花青苷经盐酸甲醇溶液振荡提取,C18色谱柱分离,二极管阵列检测器检测,以保留时间定性,外标法定量。结果表明,花青苷在0.5~50 mg/L(矮牵牛素-3-O-葡萄糖苷和芍药素-3-O-葡萄糖苷)和0.5~100 mg/L(其余14种花青苷)范围内,线性关系良好,相关系数(R^(2))>0.99;方法检出限为0.05~0.20 mg/kg,方法定量限为0.15~0.60 mg/kg;实验室内相对标准偏差苷等16种花青苷的检测。

关键词：浆果类水果花青苷高效液相色谱法方法建立

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柑橘花青苷抑制子的发掘与功能验证

柑橘花青苷抑制子的发掘与功能验证

作者：唐周舟华中农业大学

学位级别：硕士

花青苷是植物三大色素之一,属于黄酮类化合物,水溶性良好,能协助植物抵抗各种胁迫,另外,花青苷在人类保健及医疗领域也具有重要的应用价值。花青苷广泛存在于植物的各种组织中,在多个柑橘品种的特定组织中也有积累。因此,研究柑橘中花... 详细信息

花青苷是植物三大色素之一,属于黄酮类化合物,水溶性良好,能协助植物抵抗各种胁迫,另外,花青苷在人类保健及医疗领域也具有重要的应用价值。花青苷广泛存在于植物的各种组织中,在多个柑橘品种的特定组织中也有积累。因此,研究柑橘中花青苷的生物合成途径具有重要意义。花青苷负调控因子的挖掘工作在多种植物中已有成果,但目前为止,柑橘中的花青苷负调控因子尚无相关文献报道。本研究基于柑橘及其他植物中花青苷生物合成研究进展及本实验室已有的研究结果,对柑橘中花青苷生物合成负调控因子进行了挖掘及功能验证。具体研究结果如下:1.柑橘中存在一个R2R3-MYB转录因子MYB3,序列分析发现MYB3的C-末端具有一个C2-motif,进化树分析结果表明MYB3与已报道的VvMYBC2-L1、PhMYB27、FaMYB1、PtrMYB182及MtMYB2等转录抑制因子共同聚在一类,同属于FaMYB1类。对MYB3进行柑橘原生质体亚细胞定位实验,得出MYB3定位于细胞核,具有转录因子的普遍特性,转录活性实验结果表明MYB3具有转录抑制活性,因此得出MYB3是一个具有转录抑制活性的转录因子;2.利用实时荧光定量PCR对MYB3及转录正调控因子Ruby的表达量进行分析,结果显示MYB3与Ruby共表达,且与花青苷的积累呈正相关,在多种不同的柑橘品种中均存在该规律;3.将MYB3稳定表达于野生型拟南芥及Ruby超表达系拟南芥中,对MYB3及花青苷生物合成途径的结构基因进行实时荧光定量PCR分析其表达量,发现MYB3的表达量与结构基因的表达量呈反比,同时与花青苷含量呈反比,故推测MYB3能抑制抑制花青苷的生物合成,是结构基因表达降低所导致的;4.通过酵母双杂交、酵母单杂交、双分子荧光互补及烟草双荧光素酶瞬时表达实验验证得出,MYB3并非通过与Ruby竞争结合CsbHLH1也不直接结合在结构基因启动子上来发挥作用,而是通过抑制BMW复合体的活性来抑制花青苷的合成。

关键词：柑橘花青苷转录抑制因子 MYB

UPLC-MS/MS分析不同品种蓝莓中的花青苷

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中国实验方剂学杂志 2018年第21期24卷 62-68页

作者：刘彩芬秦公伟韩豪李新生刘旭赵保承李奔陕西理工大学生物科学与工程学院陕西汉中723000 陕西省资源生物重点实验室陕西汉中723000 陕南秦巴山区生物资源综合开发利用协同创新中心陕西汉中723000

目的：采用超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱联用技术（UPLC-MS/MS）分析12个品种蓝莓中的花青苷。方法：80%乙醇作为溶剂超声辅助提取蓝莓花青苷,提取液经离心后的上清液于旋转蒸发仪浓缩用6%甲酸水溶液定容至刻度线,超滤后,采用UPLC... 详细信息

目的：采用超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱联用技术（UPLC-MS/MS）分析12个品种蓝莓中的花青苷。方法：80%乙醇作为溶剂超声辅助提取蓝莓花青苷,提取液经离心后的上清液于旋转蒸发仪浓缩用6%甲酸水溶液定容至刻度线,超滤后,采用UPLC-MS/MS,ACQUITY UPLC BEHC18色谱柱（2.1 mm×50 mm,1.7μm）,乙腈-6%甲酸水溶液作为流动相,进行梯度洗脱,在电喷雾离子源（ESI）正离子模式下,用MRM模式监测。结果：12个品种蓝莓中花青苷种类较为相似,花青苷种类最丰富的蓝莓品种是R26,含有23种,花青苷种类最少的蓝莓品种是N15,含有20种,飞燕草素和锦葵素是蓝莓中最主要的两大类花青苷。12个品种蓝莓中总花青苷含量在820.43-2 114.627μg·g-1,存在显著差异（PN12〉S28〉R6〉S30〉S7-1〉S12〉S7-2〉S7-3〉N15〉N1〉N14。R系列总花青苷含量高于S系列,N系列花青苷含量最少。不同品种蓝莓中各类花青苷含量亦存在显著差异。结论：12个品种蓝莓中的总花青苷含量存在显著差异,可为以蓝莓花青苷为功能成分的保健品、药物开发提供基础数据,同时也为蓝莓花青苷活性实验、蓝莓花青苷的检测分析提供参考依据。

关键词：超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱蓝莓花青苷鉴定

MdMYB1启动子甲基化对不同色泽类型苹果品种果皮花青苷合成的调控作用

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分子植物育种 2018年第22期16卷 7415-7422页

作者：常博马长青刘聪刘莉王英杨亚洲赵政阳西北农林科技大学园艺学院杨凌712100

为探究MdMYB1启动子甲基化修饰对不同色泽类型苹果品种果皮花青苷合成的影响,本研究以十个苹果品种(‘秦阳’,‘新红星’,‘华冠’,‘岳帅’,‘金富’,‘金钟’,‘瑞雪’,‘王林’,‘岱绿’和‘印度’)为研究试材,对其分别进行套袋与不... 详细信息

为探究MdMYB1启动子甲基化修饰对不同色泽类型苹果品种果皮花青苷合成的影响,本研究以十个苹果品种(‘秦阳’,‘新红星’,‘华冠’,‘岳帅’,‘金富’,‘金钟’,‘瑞雪’,‘王林’,‘岱绿’和‘印度’)为研究试材,对其分别进行套袋与不套袋处理,选取解袋0 d和解袋10 d两个时期果实,分析果皮花青苷和叶绿素含量,并通过亚硫酸氢盐测序的方法对MdMYB1启动子的三个区段a、b和c (-1 062 bp～-964 bp,-1 898 bp～-1 633 bp和-2 026 bp～-1 870 bp)进行甲基化水平分析。结果表明:套袋处理可以显著提高果皮中花青苷的含量且降低叶绿素含量,并且MdMYB1启动子三个试验区段对不同色泽类型品种的果皮着色的调控作用是有差异的。区段a、b、c与绿色品种‘岱绿’和‘印度’的果皮着色密切相关;但在黄色品种‘金富’、‘金钟’、‘瑞雪’和‘王林’中,三个试验区段均不是其关键甲基化区段;区段a的甲基化修饰与四个红色品种的着色有显著相关性,而区段c则不是其关键的区段,此外,区段b是‘新红星’和‘华冠’品种MdMYB1启动子上的关键甲基化区段,但与‘秦阳’和‘岳帅’却没有显著的相关性。本研究为探究甲基化修饰对于苹果果皮着色的作用机理提供理论参考。

关键词：苹果 MdMYB1启动子甲基化花青苷

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洋葱花青苷生物合成调控研究进展

分子植物育种 2020年第19期18卷 6385-6391页

作者：曹琳娇李晓杰焦棒棒袁升凯赵李锋马长生梁毅河南农业大学园艺学院郑州450002 北京市农林科学院蔬菜研究中心北京100097 河南豫艺种业科技发展有限公司郑州450000

洋葱富含花青苷、蔗糖、膳食纤维等营养成分,是中国重要的出口创汇型蔬菜。鳞茎颜色是选育和食用洋葱的重要指标,其颜色受花青苷及其衍生物的种类和积累水平的影响。花青苷是植物中重要的次生代谢产物,在植物生长发育中具有重要作用,广... 详细信息

洋葱富含花青苷、蔗糖、膳食纤维等营养成分,是中国重要的出口创汇型蔬菜。鳞茎颜色是选育和食用洋葱的重要指标,其颜色受花青苷及其衍生物的种类和积累水平的影响。花青苷是植物中重要的次生代谢产物,在植物生长发育中具有重要作用,广泛参与了植物防御紫外线和抗逆境胁迫过程。花青苷生物合成受相关结构基因和调节基因的共同调控,环境因子也会影响花青苷的合成。分子水平上对洋葱花青苷遗传机制的研究在不断加深,但研究进展还是落后于拟南芥、玉米等模式作物。本研究简要论述了相关结构基因、调节基因及环境因子对花青苷生物合成的影响,为洋葱花青苷的进一步研究提供参考。

关键词：洋葱花青苷结构基因调节基因环境因子