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清香酒醅中高自溶度乳酸菌的分离鉴定及其自溶酶的研究

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清香酒醅中高自溶度乳酸菌的分离鉴定及其自溶酶的研究

作者：李智琪山西师范大学

学位级别：硕士

乳酸菌在白酒酿造中起到非常重要的作用,乳酸菌生产的乳酸保障酿酒过程顺利进行,能增加酒体浓厚度,丰富酒体风味,通过酯化作用形成乳酸乙酯是中国白酒重要的香气成分,尤其是清香白酒最要的两种香气成分之一。夏季,酿酒环境温度明显升高... 详细信息

乳酸菌在白酒酿造中起到非常重要的作用,乳酸菌生产的乳酸保障酿酒过程顺利进行,能增加酒体浓厚度,丰富酒体风味,通过酯化作用形成乳酸乙酯是中国白酒重要的香气成分,尤其是清香白酒最要的两种香气成分之一。夏季,酿酒环境温度明显升高,酒醅乳酸菌过量生长会导致酒醅酸度过高,使新酒量降低,同时乳酸乙酯比例升高,影响了基酒的质量。目前,关于酒醅乳酸菌的生长控制仍缺乏有效手段。因此,本课题拟从清香酒醅中分离鉴定乳酸菌,筛选高自溶度菌株研究其自溶特性为清香白酒发酵过程中乳酸菌的控制提供依据。本课题分离鉴定清香酒醅来源的乳酸菌,挑选高自溶度菌株,从环境温度、pH、葡萄糖浓度、氯化钠、乳酸钠及SDS方面考察其自溶特性;通过自溶酶的抽提,SDS-PAGE酶谱分析,LC-MS对其自溶酶进行鉴定;主要研究结果如下:通过MRS-碳酸钙培养基从清香酒醅中分离筛选出47株乳酸菌,结合生理生化特征和16S r DNA序列比对分析法,发现短乳杆菌有20株,戊糖乳杆菌4株,布氏乳杆菌7株,植物乳杆菌16株。采用比浊法分析47株乳酸菌的自溶度得到各菌株的自溶排序,筛选得到9株自溶度较高的乳酸菌:MC46、MC30-2、LB27、YP15-1、SL25-1、SL33、MC46-2、YP49-1、LB60。从多方面考察乳酸菌自溶特性。在白酒酿造的温度范围内（约15～35℃）,大多数菌株的自溶度随温度的升高而增加;在酒醅发酵的pH范围内（3.5～6.5）,大多数菌株的自溶度随pH的升高而增大;1%、2%、3%和4%四种浓度的葡萄糖浓度对乳酸菌的自溶都起到促进作用,其中4%的葡萄糖浓度对乳酸菌自溶的促进作用最强;在0-3%的Na Cl范围内,自溶度整体先升高然后降低,在1%的浓度下,有8个菌株自溶度最大。在0-3%的乳酸钠范围内,乳酸钠对乳酸菌自溶均有促进作用,各菌株自溶度变化比较相似,0.5%浓度的乳酸钠对乳酸菌的自溶促进作用略强一些。SDS会对自溶有抑制功能,当浓度为0.1%时,乳酸菌的自溶几乎都被抑制。选取自溶度较高的菌株L.brevis MC46,采用复性SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色等方法对对其全细胞提取液进行酶谱分析,得到半透明条带LC-MS鉴定,得到的肽段涉及到269种蛋白,其中6种是细菌细胞壁肽聚糖水解酶,即2个肽酶（Peptidase）、1个N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶（N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase）、2个羧肽酶（Carboxypeptidase）和1个寡肽链酶（Oligopeptide chain enzyme）。将对数期、稳定期及对数期饥饿处理的L.brevis MC46全细胞提取液SDS-PAGE后,取差异条带进行LC-MS鉴定,得到的肽段鉴定涉及到329种蛋白被鉴定,其中12种与乳酸菌自溶中细胞壁肽聚糖水解相关即有1个羧肽酶（Carboxypeptidase）和2个内肽酶（Endopeptidase）和9个蛋白酶（protease）。

关键词：清香型白酒乳酸菌自溶自溶酶 LC-MS分析

肺炎链球菌自溶酶(LytA)蛋白T细胞表位的预测、筛选及确定

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免疫学杂志 2014年第1期30卷 21-28页

作者：麦璟莹梁雪清高志岩马长玲袁竹青梁广明梁雪清广州医科大学病原生物学与免疫学教研室 510182 广州医科大学形态学实验中心广州医科大学生物技术专业

目的确定肺炎链球菌自溶酶(LytA)蛋白CD4 T细胞及CD8 T细胞的表位。方法通过生物信息学方法预测肺炎链球菌LytA蛋白分子小鼠的MHC-Ⅰ结合肽(CD8 T细胞表位)和MHC-Ⅱ结合肽(CD4 T细胞表位)序列并人工合成相应肽段;经诱导表达、纯化、透... 详细信息

目的确定肺炎链球菌自溶酶(LytA)蛋白CD4 T细胞及CD8 T细胞的表位。方法通过生物信息学方法预测肺炎链球菌LytA蛋白分子小鼠的MHC-Ⅰ结合肽(CD8 T细胞表位)和MHC-Ⅱ结合肽(CD4 T细胞表位)序列并人工合成相应肽段;经诱导表达、纯化、透析、去内毒素、定量等步骤得到纯化的rLytA蛋白用以免疫小鼠;分离每只免疫组小鼠和对照组小鼠的脾及淋巴结细胞并分别与每条人工合成的候选表位肽段体外共培养,取培养上清进行双夹心ELISA检测每组细胞IFN-γ的产生情况;用初步筛选到的表位多肽刺激小鼠的脾及淋巴结细胞并进行细胞内染色及细胞流式技术检测,筛选出LytA蛋白分子T细胞表位。结果利用多种方法分析了LytA蛋白分子的MHC-Ⅰ结合肽及MHC-Ⅱ结合肽,经整理得到候选MHC-Ⅰ结合肽26条,候选MHC-Ⅱ结合肽7条,并进行了人工合成。利用分子生物学技术获得了rLytA蛋白并成功免疫了小鼠;双夹心ELISA结果初步提示:肽段LⅠ4、LⅠ5、LⅠ6、LⅠ7、LⅠ11、LⅠ12、LⅠ13、LⅠ14、LⅠ25以及肽段LⅡ3、LⅡ4、LⅡ5刺激免疫小鼠细胞产生的IFN-γ量比相应的对照小鼠显著升高;细胞流式技术进一步确定:经肽段LⅠ4、LⅠ6、LⅠ7、LⅠ11、LⅠ12、LⅠ13、LⅠ14及LⅠ25刺激后,免疫小鼠细胞中IFN-γ和CD8双阳性的细胞百分比较对照小鼠细胞的百分比显著升高;经肽段LⅡ4和LⅡ5刺激后,免疫小鼠细胞中IFN-γ和CD4双阳性的细胞百分比较对照小鼠细胞的百分比显著升高。结论确定了肺炎链球菌LytA蛋白分子2个CD4 T细胞及8个CD8 T细胞的表位。

关键词：肺炎链球菌自溶酶 T细胞表位

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不同温度处理对海参自溶酶及品质的影响

食品科技 2014年第10期39卷 159-163页

作者：李江阔郭兴月张鹏侯英雪张鹤国家农产品保鲜工程技术研究中心(天津) 天津市农产品采后生理与贮藏保鲜重点实验室天津300384 沈阳农业大学食品学院沈阳110866 大连鑫玉龙海洋珍品有限公司大连116034

海参在离开海水后会发生自溶,这是由于体内存在自溶酶,实验以鲜活海参为实验材料,研究了海参自溶酶在不同贮期的变化情况,并同时测定营养指标——水分和脂肪、新鲜度指标——pH值和挥发性盐基氮。分别探讨海参自溶酶与海参品质在不同温... 详细信息

海参在离开海水后会发生自溶,这是由于体内存在自溶酶,实验以鲜活海参为实验材料,研究了海参自溶酶在不同贮期的变化情况,并同时测定营养指标——水分和脂肪、新鲜度指标——pH值和挥发性盐基氮。分别探讨海参自溶酶与海参品质在不同温度贮藏下的变化情况。结果表明:低温可以延长海参的贮藏时间,并能较好的延缓海参水分和脂肪含量的降低,抑制海参挥发性盐基氮的增大和pH值的降低,所以可以较好的保持海参的营养品质和新鲜度,而且较低温度下海参自溶酶的活性比较高温度下的海参高,其中0℃的贮藏效果最佳。

关键词：鲜活海参低温自溶酶品质

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超高压处理对海参自溶酶活性影响的研究

高压物理学报 2009年第5期23卷 377-383页

作者：夏远景刘志军李宁陈淑花邓记松刘学武李志义大连理工大学流体与粉体工程研究设计所辽宁大连116012 大连理工大学生物科学与工程系辽宁大连116023

海参的超高压处理与传统的处理方法相比有许多优越性,具有十分广阔的应用前景。研究了超高压处理过程中压力(0.1～550MPa)、保压时间(0～30min)、温度(24～62℃)及保压方式对海参自溶酶活性的影响。在室温、保压20min的条件下,200MPa左... 详细信息

海参的超高压处理与传统的处理方法相比有许多优越性,具有十分广阔的应用前景。研究了超高压处理过程中压力(0.1～550MPa)、保压时间(0～30min)、温度(24～62℃)及保压方式对海参自溶酶活性的影响。在室温、保压20min的条件下,200MPa左右较低压力下酶活性降低,相对残存活性为88.25%;250MPa较高压力下自溶酶被激活,酶活性为106.77%;550MPa高压下酶活性最低为29.81%。自溶酶活性随保压时间和温度的增加先上升后下降;保压方式对自溶酶活性的影响不大。同时利用误差反向传播神经网络(Back Propagation Neural Network,BP人工神经网络),模拟了超高压钝酶效果,与实验结果比较,平均相对误差为0.9%,可以获得较好的预测结果。研究结果表明,在一定的压力、保压时间和温度下,酶被激活,其活性上升;而在一定的压力、保压时间和温度下,酶被钝化,活性降低。对优化海参超高压钝酶工艺具有一定的参考价值。

关键词：超高压海参自溶酶神经网络

肺炎链球菌重组自溶酶（Re-LytA）滴鼻免疫小鼠的实验研究

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中华微生物学和免疫学杂志 2008年第7期28卷 629-633页

作者：甘慧泉鲜墨袁竹青吴忠道李明周茂华广东省人民医院病理医学部检验科广州510080 广州市呼吸疾病研究所中山大学中山医学院病原生物学教研室广州510080

目的评价重组肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae，Sp）自溶酶（autolysin，LytA）滴鼻免疫诱导小鼠抗Sp感染的保护性效果。方法用亲和层析的方法纯化出重组SpLytA蛋白，以CpG作佐剂，对小鼠进行滴鼻免疫（A组）。对照组（B组）用无... 详细信息

目的评价重组肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae，Sp）自溶酶（autolysin，LytA）滴鼻免疫诱导小鼠抗Sp感染的保护性效果。方法用亲和层析的方法纯化出重组SpLytA蛋白，以CpG作佐剂，对小鼠进行滴鼻免疫（A组）。对照组（B组）用无菌盐水滴鼻；多糖疫苗组（C组）用23价多糖疫苗肌肉注射。于末次免疫后2周，用Sp分别以滴鼻和腹腔注射两种方式进行攻击感染。攻击之前采集血清和鼻咽灌洗液等样品，采用ELISA测试其抗体水平。滴鼻攻击后4d，采集小鼠鼻咽灌洗液和肺灌洗液，进行Sp细菌计数；腹腔注射攻击后7d内观察各组小鼠死亡情况。结果B组未检测到LytA抗体和多糖抗体，C组多糖抗体阳性；A组LytA抗体（包括IgG、IgA、sIgA）均明显高于对照组，差异具有统计学意义（P〈0．05）。腹腔注射攻击后，A、C组小鼠的存活率明显高于B组（P〈0．05），A组和C组之间没有明显区别（P〉0．05）。滴鼻攻击后，A组鼻咽部灌洗液sp细菌计数明显低于B组和C组（P〈0．05）。结论Re-LytA滴鼻免疫可诱导实验小鼠产生一定的抵抗Sp感染的保护性免疫力，这种保护性的免疫力可能与sIgA相关。

关键词：肺炎链球菌自溶酶滴鼻免疫

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南美白对虾虾头主要自溶酶的分离纯化及鉴定

食品与发酵工业 2011年第3期37卷 23-26页

作者：银凤周爱梅张祥刚曹庸刘欣陈永泉华南农业大学食品学院

以水解试验为导向,采用硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-100凝胶层析、DEAE-DE52阴离子交换柱层析等手段分离纯化南美白对虾虾头主要自溶酶,同时采用抑制剂试验及SDS-PAGE对纯化蛋白酶进行鉴定。结果表明,南美白对虾虾头主要自溶酶经过纯化... 详细信息

以水解试验为导向,采用硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-100凝胶层析、DEAE-DE52阴离子交换柱层析等手段分离纯化南美白对虾虾头主要自溶酶,同时采用抑制剂试验及SDS-PAGE对纯化蛋白酶进行鉴定。结果表明,南美白对虾虾头主要自溶酶经过纯化后比活力高达2.2×106U/g,纯化倍数为96.90。丝氨酸蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)对主要自溶酶的抑制率高达91.3%;SDS-PAGE显示该酶为单一电泳带,且在电泳中与标准胰蛋白酶移动距离相同,表明南美白对虾虾头内的主要自溶酶为胰蛋白酶。

关键词：南美白对虾自溶酶分离纯化鉴定

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南极磷虾自溶酶性质的初步研究

食品科学 2011年第13期32卷 198-200页

作者：杭虞杰李学英杨宪时郭全友上海理工大学医疗器械与食品学院上海200093 中国水产科学研究院东海水产研究所上海200090

探讨南极磷虾自溶酶的最适pH值、最适温度以及抑制剂和金属离子对其活性的影响。结果表明:南极磷虾自溶酶主要含有3种酶,最适pH值分别为3.0、6.0、8.0;各最适pH值条件下最适温度分别为40、50、50～60℃之间。苯甲基磺酰氟(PMSF)和大豆... 详细信息

探讨南极磷虾自溶酶的最适pH值、最适温度以及抑制剂和金属离子对其活性的影响。结果表明:南极磷虾自溶酶主要含有3种酶,最适pH值分别为3.0、6.0、8.0;各最适pH值条件下最适温度分别为40、50、50～60℃之间。苯甲基磺酰氟(PMSF)和大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)对南极磷虾自溶酶活性有较强的抑制作用,抑制范围分别在pH3.0～9.0之间和pH6.0～10.5之间。Cu2+和Ba2+对自溶酶活性的抑制作用较强,Ca2+对自溶酶活性几乎没有抑制作用,而Mg2+对自溶酶活性有一定的激活作用。

关键词：南极磷虾自溶酶性质

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小檗碱对MRSA自溶酶系统作用的研究

中国感染与化疗杂志 2012年第4期12卷 310-312页

作者：周树勤姚芬黄源春钱元恕彭青南方医科大学珠江医院麻醉科汕头大学医学院药理学教研室汕头大学医学院附属第一医院检验科

目的探讨小檗碱与β内酰胺类抗生素对耐甲氧西林金葡菌(MRSA)的协同抗菌作用机制。方法采用蛋白印迹试验(Western-blot)测定小檗碱对MRSA的青霉素结合蛋白(PBP)2a表达的影响,TritonX-100诱导的自溶试验及自溶酶谱分析测定小檗碱对MRSA... 详细信息

目的探讨小檗碱与β内酰胺类抗生素对耐甲氧西林金葡菌(MRSA)的协同抗菌作用机制。方法采用蛋白印迹试验(Western-blot)测定小檗碱对MRSA的青霉素结合蛋白(PBP)2a表达的影响,TritonX-100诱导的自溶试验及自溶酶谱分析测定小檗碱对MRSA自溶酶系统的影响。结果小檗碱对MRSA所产PBP2a的表达无影响,但能显著诱导MRSA的自溶酶系统。结论小檗碱对自溶酶系统的激活作用可能是小檗碱增强β内酰胺类抗生素对MRSA抗菌作用的机制之一。本研究为今后小檗碱用于临床抗MRSA治疗提供了科学的理论基础。

关键词：小檗碱 β内酰胺类抗生素协同作用自溶酶

通过自溶酶相关基因的敲除提高枯草芽胞杆菌产量

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通过自溶酶相关基因的敲除提高枯草芽胞杆菌产量