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MicroRNAs与胸腺细胞发育的研究进展

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中国免疫学杂志 2019年第17期35卷 2150-2155页

作者：胡琳冒灵刘士明陈超徐林贵州省基因检测与治疗特色重点实验室遵义医科大学免疫学教研室

MicroRNAs(miRNAs)是广泛存在于真核生物体中的一组内源性非编码单链小分子RNA,长度约为22~24个核甘酸,主要通过完全结合或部分结合目的基因的3′端非编码区(3′-UTR),在转录后水平促进靶基因mRNA的降解或抑制蛋白质翻译而负调控目的基... 详细信息

MicroRNAs(miRNAs)是广泛存在于真核生物体中的一组内源性非编码单链小分子RNA,长度约为22~24个核甘酸,主要通过完全结合或部分结合目的基因的3′端非编码区(3′-UTR),在转录后水平促进靶基因mRNA的降解或抑制蛋白质翻译而负调控目的基因表达,参与调控细胞的发育、分化和凋亡。新近研究显示,miRNAs在免疫细胞的发育、增殖、分化及功能中发挥了重要调控作用。本文主要就miRNAs与胸腺细胞发育相关的研究进展做一综述。

关键词： miRNAs 胸腺细胞发育

G-CSF对急性辐射损伤小鼠胸腺细胞的细胞周期、增殖细胞及分化的影响

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中国实验血液学杂志 2011年第3期19卷 809-813页

作者：赵红霞郭梅刘铁强艾辉胜军事医学科学院附属医院血液科北京100071

本研究探讨粒细胞集落刺激因子(G-CSF)对急性辐射损伤小鼠胸腺细胞周期、凋亡及各细胞亚群增殖、分化的影响。6Gy照射BALB/c小鼠制造中重度急性辐射损伤模型,随机分为对照组及重组人G-CSF治疗组[rhG-CSF100μg/(kg.d)×14天]。用PI法检... 详细信息

本研究探讨粒细胞集落刺激因子(G-CSF)对急性辐射损伤小鼠胸腺细胞周期、凋亡及各细胞亚群增殖、分化的影响。6Gy照射BALB/c小鼠制造中重度急性辐射损伤模型,随机分为对照组及重组人G-CSF治疗组[rhG-CSF100μg/(kg.d)×14天]。用PI法检测照后72小时内胸腺细胞周期及凋亡变化,流式细胞仪检测照后7至28天不同时间点胸腺CD4-CD8-细胞4阶段及CD4+CD8+、CD8+CD4-、CD8-CD4+细胞比例。结果显示,G-CSF在照后6小时即可使胸腺细胞出现G0/G1期阻滞G-CSF组vs对照组为(82.0±5.0)%vs(75.9±2.8)%(p细胞比例影响不大。胸腺细胞受照后6小时即出现明显调亡,12小时达高峰。G-CSF组在照后6小时及12小时胸腺细胞凋亡率分别为(11.5±2.4)%、(15.5±3.3)%,对照组则分别为(16.5±2.2)%、(22.6±0.7)%,两时间点统计学差异明显(p胸腺CD4-CD8-(double negative,DN)细胞成熟分4个阶段(DN1-4),G-CSF组照后7天DN1细胞比例明显高于对照组(p细胞比例高于对照组(p细胞增殖,并使其向DN3、DN4阶段分化。G-CSF对胸腺CD4+CD8+细胞的影响主要在于减轻其恢复过程中的二次下降的程度,使其在照后28天接近正常,并明显高于对照组[(71.0±6.3)%vs(25.5±6.3)%](p胸腺细胞周期,减少胸腺细胞凋亡,促进胸腺CD4-CD8-及CD4+CD8+细胞增殖、分化,加快急性辐射损伤后中枢免疫恢复。

关键词：急性辐射损伤综合征重组人粒细胞集落刺激因子胸腺细胞

胸腺细胞诱导NRK52E细胞转分化及对其迁移能力的影响

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胸腺细胞诱导NRK52E细胞转分化及对其迁移能力的影响

作者：张成斌吉林大学

学位级别：硕士

同种异体肾移植技术已经发展成为了一种治疗各种原因引起的终末期肾脏疾病的最佳方法。在过去的几十年里，移植肾的短期存活率有了显著的提高，然而移植物的长期存活率并没有明显改善。移植肾出现严重的慢性肾功能障碍甚至功能丧失时，... 详细信息

同种异体肾移植技术已经发展成为了一种治疗各种原因引起的终末期肾脏疾病的最佳方法。在过去的几十年里，移植肾的短期存活率有了显著的提高，然而移植物的长期存活率并没有明显改善。移植肾出现严重的慢性肾功能障碍甚至功能丧失时，其主要的病理表现为肾小管萎缩和间质纤维化即移植肾纤维化。文献报道，慢性肾纤维化的形成主要是由于纤维母细胞和/或肌成纤维细胞增生并在间质内分泌过量的细胞外基质引起的，而纤维母细胞和/或肌成纤维细胞的一个重要来源为肾小管上皮细胞向间充质细胞的转分化。临床观察发现，肾移植术后严重的急性排斥反应及其频繁发作可明显缩短移植物纤维化发生的时间。大部分移植肾急性排斥反应属于急性T细胞介导的排斥反应，在病理上主要表现为肾小管上皮细胞内有炎细胞浸润，且炎细胞以T淋巴细胞为主。目前，急性排斥反应影响慢性移植肾纤维化发生的具体机制尚不明确。目的：本实验以肾小管上皮细胞株NRK52E细胞为研究对象，通过体外实验观察大鼠胸腺细胞诱导NRK52E细胞发生上皮-间充质细胞转分化的能力，以及转分化后NRK52E细胞迁移能力的改变。期待为急性排斥反应影响慢性移植肾纤维化发生的机制提供可能的解释。方法：采用ConA（终浓度为5μg/ml）和PHA（终浓度为10μg/ml）体外刺激大鼠胸腺细胞24小时后，倒置显微镜下观察胸腺细胞形态变化，同时用流式细胞术分析胸腺细胞的细胞周期。以及用酶联免疫吸附法检测胸腺细胞分泌IFN-γ和IL-2的情况。将刺激24小时后的胸腺细胞离心，并用无血清DMEM培养基洗涤细胞沉淀三次，收集第三次洗涤培养基做对照培养基。无血清DMEM培养基重悬胸腺细胞，继续培养48小时，离心取上清做诱导培养基。将NRK52E细胞分为对照组和诱导组，两组细胞的孵育条件分别为：45%DMEM培养基+45%对照培养基+10%FBS和45%DMEM培养基+45%诱导培养基+10%FBS。于诱导后24小时在倒置相差显微镜下观察细胞形态，用RT-PCR法、免疫细胞化学染色和免疫荧光染色检测NRK52E细胞的转分化状态。另外通过划痕实验观察诱导后NRK52E细胞迁移能力的改变。结果：经过ConA和PHA联合刺激24小时后，胸腺细胞体积增大，直径由14.00±1.2μm增加至20.36±2.1μm（P＜0.05），细胞增殖指数也由对照组的19.23％±2.37％增加至刺激组的27.45%±1.77％（P＜0.05）。刺激48小时后胸腺细胞分泌干扰素-γ的量由633.5±18.3pg/ml升高至791±26.7pg/ml（P＜0.05），而IL-2的分泌量在刺激24、48和72小时后，分别由4352.65±67.1pg/ml、4241.5±56.2pg/ml、4673.5±87.9pg/ml升高至5531.79±40.2pg/ml、5267.45±31.7pg/ml、5387.1±89.2pg/ml，（P＜0.05）。以上结果提示，ConA和PHA的联合刺激促进了胸腺细胞的增殖、活化和细胞因子的分泌。形态观察发现，经过诱导培养基诱导24小时后，诱导组NRK52E细胞变为间充质细胞样的长梭形，细胞间隙变大，排列稀疏。RT-PCR结果显示，诱导后NRK52E细胞E-Ca表达下降，mRNA的相对表达量由0.764±0.032下降至0.214±0.025（P＜0.05）;而α-SMA表达升高，mRNA的相对表达量由0.56±0.031升高至0.647±0.021（P＜0.05）。此外免疫细胞化学染色和免疫荧光染色均发现，诱导后NRK52E细胞上皮细胞标记物E-Ca和CK-19表达下降而间充质细胞标记物α-SMA和Vimentin表达升高。划痕试验还发现，诱导后NRK52E细胞迁移能力增加，相对迁移率由对照组的62.1%±6.0%增加至诱导组的83.0%±2.8%（P＜0.05）。结论：大鼠胸腺细胞能诱导体外培养的肾小管上皮细胞发生上皮-间充质细胞转分化，且转分化后的肾小管上皮细胞的体外迁移能力增加。

关键词：慢性移植肾肾病急性排斥反应上皮-间充质细胞转分化胸腺细胞

尼古丁通过TET2调控的Fas去甲基化促进胸腺细胞凋亡

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尼古丁通过TET2调控的Fas去甲基化促进胸腺细胞凋亡

作者：刘莎武汉大学

学位级别：硕士

研究背景:尼古丁作为香烟中最主要的成瘾和毒性成分,在吸烟引起的免疫系统损伤和相关疾病中发挥着关键和主导作用。本室前期研究显示,孕期尼古丁暴露可促进胎胸腺细胞及CD4单阳性（CD4 single positive,CD4SP）细胞凋亡,引起CD4+初始T... 详细信息

研究背景:尼古丁作为香烟中最主要的成瘾和毒性成分,在吸烟引起的免疫系统损伤和相关疾病中发挥着关键和主导作用。本室前期研究显示,孕期尼古丁暴露可促进胎胸腺细胞及CD4单阳性（CD4 single positive,CD4SP）细胞凋亡,引起CD4+初始T细胞输出减少,进而导致子代免疫功能紊乱,其中Fas通路发挥重要的促凋亡作用,但具体的分子机制还不清楚。有研究证明,尼古丁可调控胎组织基因的DNA甲基化水平,且Fas表达可受DNA甲基化的调控。因此我们推测,尼古丁可能通过调控Fas的DNA甲基化修饰促进胸腺细胞凋亡。目的:观察尼古丁对胸腺细胞凋亡的影响,并从DNA甲基化修饰角度,探讨Fas凋亡通路介导的尼古丁促胸腺细胞凋亡的分子机制。方法:（1）胸腺细胞凋亡及Fas通路基因表达:选取出生后3周断奶ICR健康小鼠,无菌环境下建立原代胸腺细胞培养体系,分成正常对照组和尼古丁不同剂量（25、50、100、200 和 400 μM）组,给药 48 h,Cell Counting Kit-8（CCK-8）法检测细胞活力。选取合适的尼古丁剂量（25、50和100 μM）给药48h,流式细胞术（Fluorescence Activating Cell Sorter,FACS）检测总胸腺细胞及CD4SP细胞凋亡水平的变化;根据尼古丁量效结果,选取50 μM尼古丁分别处理胸腺细胞0、24、48、72 h,FACS检测总胸腺细胞及CD4SP细胞凋亡水平的变化。实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR,qPCR）检测胸腺细胞α7 nAChR和Fas凋亡通路相关基因（Fas、Caspase 8、Caspase 3）的mRNA表达,FACS检测胸腺细胞膜表面的Fas蛋白表达,Caspase酶活性检测试剂盒测定Caspase 8和Caspase 3的活性蛋白水平。（2）Fas甲基化及甲基化酶参与尼古丁促胸腺细胞凋亡:首先,根据尼古丁对胸腺细胞的量效和时效作用结果,选择50 μM作为尼古丁给药剂量和48 h作为尼古丁给药时间,分子量阵列技术（SequenomMassARRAY）检测Fas启动子区的DNA甲基化水平,qPCR检测甲基化酶（TET1、TET2、TET3、Dnmt 1、Dnmt 3a、Dnmt 3b）的mRNA表达。然后选取表达显著改变的基因TET2进行siRNA干扰,Western blot检测TET2的蛋白表达,FACS检测总胸腺细胞及CD4SP细胞的凋亡比例及细胞膜表面的Fas蛋白表达,Sequenom MassARRAY检测Fas启动子区的DNA甲基化水平。（3）研究α7nAChR在尼古丁诱导的胸腺细胞凋亡中的作用:尼古丁处理前1小时给予尼古丁受体特异性抑制剂α-银环蛇毒素（α-Bungarotoxin,α-Btx）1 μg/mL或PBS处理,FACS检测总胸腺细胞及CD4SP细胞凋亡水平的变化和细胞膜表面的Fas蛋白表达,Caspase酶活性检测试剂盒测定Caspase 8和Caspase 3的活性蛋白水平,Western blot检测TET2的蛋白表达,Sequenom MassARRAY检测Fas启动子区的DNA甲基化水平。结果:（1）尼古丁促进胸腺细胞凋亡并激活α7 nAChR/Fas通路基因的表达:①细胞活性结果:25μM尼古丁对胸腺细胞活力没有显著影响,而50～200μM尼古丁呈剂量依赖性降低了胸腺细胞的活力（P＜0.05,P＜0.01）。②尼古丁量效与时效实验结果:尼古丁处理48h后,25 μM尼古丁对小鼠总胸腺细胞和CD4SP细胞的凋亡无明显影响,而50和100μM尼古丁显著增加了二者的凋亡比例;时效结果显示,尼古丁作用24h对胸腺细胞的凋亡无明显影响,随着尼古丁作用时间的延长,48～72h胸腺细胞的凋亡率呈时间依赖性显著增加（P＜0.01）。③α7nAChR/Fas凋亡通路基因的表达:50和100μM尼古丁呈剂量依赖性增强了α7 nAChR、Fas、Caspase 8和Caspase 3的mRNA及蛋白或活性蛋白的表达。（2）Fas基因DNA甲基化及甲基化酶介导尼古丁促胸腺细胞凋亡:①Fas甲基化和甲基化酶表达的结果:尼古丁处理后,胸腺细胞Fas基因启动子区核酸（nuleotide,nt）-2394、nt-2441 及 nt+295 的甲基化水平显著降低（P＜0.05）,nt+456的甲基化水平也呈现降低趋势（P=0.06）。50和100μM尼古丁显著增加了 TET2的表达,各浓度尼古丁均对TET1、TET3、Dnmt 1、Dnmt 3a、Dnmt 3b的表达无明显影响。②siRNA瞬时转染结果:TET2表达降低后,尼古丁诱导的总胸腺细胞和CD4SP细胞凋亡效应、Fas去甲基化及Fas表达升高均被抑制。（3）α7nAChR介导Fas去甲基化及胸腺细胞凋亡:添加α-Btx后,尼古丁诱导的总

关键词：尼古丁胸腺细胞凋亡 DNA甲基化 Fas

长期铅暴露对小鼠胸腺细胞活化后诱导细胞凋亡的影响

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环境科学学报 2013年第3期33卷 872-876页

作者：黄青松牛志国孙启蒙赵晓楠牛艳华聂慧岩魏小辉新乡医学院微生物学教研室新乡453003 新乡医学院免疫学教研室新乡453003 新乡医学院临床医学系新乡453003

为探讨铅暴露对小鼠胸腺T细胞活化后诱导细胞凋亡的影响,将24只健康初断乳21日龄清洁级雄性KM小鼠随机分为4组:对照(蒸馏水)组和低(200 mg·L-1)、中(400 mg·L-1)、高(800 mg·L-1)剂量乙酸铅染毒组,每组6只.采用自由饮水方式进行染毒... 详细信息

为探讨铅暴露对小鼠胸腺T细胞活化后诱导细胞凋亡的影响,将24只健康初断乳21日龄清洁级雄性KM小鼠随机分为4组:对照(蒸馏水)组和低(200 mg·L-1)、中(400 mg·L-1)、高(800 mg·L-1)剂量乙酸铅染毒组,每组6只.采用自由饮水方式进行染毒,连续染毒12周.染毒结束后,分离胸腺细胞,采用脂质体介导法将NFκB、AP-1、NFAT的荧光素酶报告基因转染到胸腺T细胞,刺激48 h后,检测荧光素酶活性.刺激胸腺细胞后,采用流式细胞仪检测凋亡相关膜分子Fas、FasL活性及细胞凋亡率.结果表明,与健康对照组小鼠相比,中、高剂量铅暴露组小鼠胸腺T细胞膜表面Fas及FasL表达明显增强(p细胞凋亡率明显增加(p胸腺T细胞的NFκB、AP-1、NFAT转录活性明显增加(p细胞凋亡率明显增加(p胸腺T细胞3种核因子转录活性明显下降(p细胞凋亡率明显降低(p<0.05),且随着染铅剂量增加,均呈现下降趋势.

关键词：重金属铅胸腺细胞活化后诱导细胞凋亡

辐射对Jurkat细胞P21蛋白及ICR小鼠胸腺细胞p21基因表达的影响

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中华放射医学与防护杂志 2011年第2期31卷 134-137页

作者：倪冠英武宁郭海卓金顺子吉林省肿瘤医院PET-CT中心长春130021 吉林大学中日联谊医院放疗科吉林大学公共卫生学院卫生部放射生物学重点实验室

目的探讨电离辐射对Jurkat细胞P21蛋白和ICR小鼠胸腺细胞p21基因表达的影响。方法采用流式细胞术（FCM），检测0、0．5、1．0、2．0、4．0及6.0GyX射线照射后Jurkat细胞中P21蛋白表达的变化。采用实时定量PCR技术，分别检测0、0．5、1．... 详细信息

目的探讨电离辐射对Jurkat细胞P21蛋白和ICR小鼠胸腺细胞p21基因表达的影响。方法采用流式细胞术（FCM），检测0、0．5、1．0、2．0、4．0及6.0GyX射线照射后Jurkat细胞中P21蛋白表达的变化。采用实时定量PCR技术，分别检测0、0．5、1．0、2．0、4．0及6．0GyX射线照射后4和24h小鼠胸腺及脾细胞中p21基因表达的变化。结果不同剂量x射线照射后12和24h，Jurkat细胞中P21蛋白表达在0.5-4.0Gy范围内均随剂量的增大而升高（t=-24.23～-3.96，P〈0.05），6Gy时均出现表达下降（t=-11.19、-14.50，P〈0.05）；与假照射组相比，在0～6.0Gy照射后4和24h，小鼠胸腺及脾细胞中p21基因的相对表达量均随剂量增大逐渐增加（t=-29.96～8.80，P〈0.05）；并于6.0Gy时达最高（t=-11.84-3.42，P〈0.05），仅胸腺细胞1Gy照射后4h除外（t=-3.42，P〉0.05）。结论x射线能诱导P21蛋白及基因表达增加，并在一定剂量范围内存在良好的剂量-效应关系。

关键词：电离辐射 Jurkat细胞 P21蛋白 p21基因胸腺细胞脾细胞

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胸腺细胞的阳性选择与阴性选择

中国医学科学院学报 2002年第5期24卷 530-532页

作者：吴迪朱立平何维中国协和医科大学临床医学专业98级北京100730 Department of Immunology Institute of Basic Medical SciencesCAMS and PUMCBeijing 100005

T细胞在胸腺中发育成熟,在机体的特异性免疫应答中起着核心作用。胸腺细胞的发育要经历阳性选择和阴性选择。阳性选择决定了成熟T细胞的MHC限制性,阴性选择使机体获得自身免疫耐受。定量(亲合力)理论认为,胸腺细胞与其微环境中胸腺基质... 详细信息

T细胞在胸腺中发育成熟,在机体的特异性免疫应答中起着核心作用。胸腺细胞的发育要经历阳性选择和阴性选择。阳性选择决定了成熟T细胞的MHC限制性,阴性选择使机体获得自身免疫耐受。定量(亲合力)理论认为,胸腺细胞与其微环境中胸腺基质细胞的亲合力不同导致产生的胞内整合信号不同,当达到某一特定阈值时,便会发生阳性选择或阴性选择。本文就选择的机制及阳性选择与阴性选择的关系作一简要综述。

关键词：胸腺细胞阳性选择阴性选择

肺炎克雷伯菌肺炎对大鼠胸腺细胞凋亡的影响及其机制

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中华急诊医学杂志 2011年第6期20卷 627-630页

作者：雷澍朱美飞江荣林吴建浓浙江中医药大学附属第一医院ICU 杭州310006

目的探讨肺炎克雷伯菌肺炎对大鼠胸腺细胞凋亡的影响及可能的作用机制。方法48只Sprague－Dawley大鼠随机（随机数字法）分为对照组和感染组，每组24只。采用气管穿刺注入感染法制作大鼠肺炎克雷伯菌肺炎模型。分别于接种后的第2，4，6... 详细信息

目的探讨肺炎克雷伯菌肺炎对大鼠胸腺细胞凋亡的影响及可能的作用机制。方法48只Sprague－Dawley大鼠随机（随机数字法）分为对照组和感染组，每组24只。采用气管穿刺注入感染法制作大鼠肺炎克雷伯菌肺炎模型。分别于接种后的第2，4，6天分批处死动物，分别采用TUNEL法检测大鼠胸腺细胞凋亡及免疫组化法检测凋亡相关基因Cleaved Caspase-3、Bcl-2和Fas的表达。结果与同时间点对照组相比，感染组胸腺细胞凋亡增加，凋亡指数和胸腺细胞Cleaved Caspase-3和Fas表达水平升高，Bcl-2表达水平下降。感染组随着接种时间的延长凋亡指数和胸腺细胞Cleaved Caspase-3表达水平持续增加，胸腺细胞Fas表达水平在第4天达到高峰，胸腺细胞Bcl-2表达水平持续下降，而对照组上述各指标无明显动态变化。结论肺炎克雷伯菌肺炎可诱导胸腺细胞凋亡增加，其机制可能与Bcl-2表达减少和Fas表达增多有关。不同凋亡调控途径在肺炎不同时期对凋亡的影响亦有所不同，Fas的作用在肺炎第4天后开始减弱而Bcl-2的作用继续增强。

关键词：肺炎克雷伯菌肺炎胸腺细胞大鼠凋亡 Cleaved Caspase-3 Bcl-2 Fas

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长期铅暴露对小鼠胸腺细胞亚群分化的影响

环境与健康杂志 2012年第5期29卷 423-425页

作者：黄青松常海敏孙启蒙赵晓楠牛艳华聂慧岩牛志国新乡医学院微生物学教研室河南新乡453003 新乡医学院法医学教研室新乡医学院临床医学系新乡医学院免疫学教研室

目的探讨铅暴露对小鼠胸腺细胞不同亚群的影响。方法将24只健康初断乳21日龄清洁级雄性KM小鼠随机分为4组,分别为对照(蒸馏水)组和低(200 mg/L)、中(400 mg/L)、高(800 mg/L)剂量乙酸铅染毒组,每组6只。采用自由饮水方式进行染毒,连续染... 详细信息

目的探讨铅暴露对小鼠胸腺细胞不同亚群的影响。方法将24只健康初断乳21日龄清洁级雄性KM小鼠随机分为4组,分别为对照(蒸馏水)组和低(200 mg/L)、中(400 mg/L)、高(800 mg/L)剂量乙酸铅染毒组,每组6只。采用自由饮水方式进行染毒,连续染毒12周。采用流式细胞技术检测小鼠外周血和胸腺内不同T细胞亚群的百分率。结果与对照组比较,中、高剂量乙酸铅染毒组小鼠外周血和胸腺中αβT细胞百分率和CD4+T细胞百分率明显降低,γδT细胞百分率明显增加(P细胞明显增加(细胞百分率明显下降(P胸腺中CD4+T细胞和CD8+T细胞百分率均明显减少(P胸腺αβT细胞百分率、CD4+T细胞百分率、αβT/γδT值以及胸腺CD4/CD8值均呈现下降,而外周血和胸腺γδT细胞百分率以及外周血CD8+T细胞百分率均呈现上升趋势。结论长期铅暴露可导致小鼠胸腺细胞亚群异常导致免疫损伤。

关键词：金属重铅胸腺细胞细胞亚群