胸腺细胞诱导NRK52E细胞转分化及对其迁移能力的影响

作     者：张成斌 

作者单位：吉林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：吴珊

授予年度：2012年

学科分类：1002[医学-临床医学] 10[医学] 

主      题：慢性移植肾肾病 急性排斥反应 上皮-间充质细胞转分化 胸腺细胞 

摘      要：同种异体肾移植技术已经发展成为了一种治疗各种原因引起的终末期肾脏疾病的最佳方法。在过去的几十年里，移植肾的短期存活率有了显著的提高，然而移植物的长期存活率并没有明显改善。移植肾出现严重的慢性肾功能障碍甚至功能丧失时，其主要的病理表现为肾小管萎缩和间质纤维化即移植肾纤维化。文献报道，慢性肾纤维化的形成主要是由于纤维母细胞和/或肌成纤维细胞增生并在间质内分泌过量的细胞外基质引起的，而纤维母细胞和/或肌成纤维细胞的一个重要来源为肾小管上皮细胞向间充质细胞的转分化。临床观察发现，肾移植术后严重的急性排斥反应及其频繁发作可明显缩短移植物纤维化发生的时间。大部分移植肾急性排斥反应属于急性T细胞介导的排斥反应，在病理上主要表现为肾小管上皮细胞内有炎细胞浸润，且炎细胞以T淋巴细胞为主。目前，急性排斥反应影响慢性移植肾纤维化发生的具体机制尚不明确。 目的：本实验以肾小管上皮细胞株NRK52E细胞为研究对象，通过体外实验观察大鼠胸腺细胞诱导NRK52E细胞发生上皮-间充质细胞转分化的能力，以及转分化后NRK52E细胞迁移能力的改变。期待为急性排斥反应影响慢性移植肾纤维化发生的机制提供可能的解释。 方法：采用ConA（终浓度为5μg/ml）和PHA（终浓度为10μg/ml）体外刺激大鼠胸腺细胞24小时后，倒置显微镜下观察胸腺细胞形态变化，同时用流式细胞术分析胸腺细胞的细胞周期。以及用酶联免疫吸附法检测胸腺细胞分泌IFN-γ和IL-2的情况。将刺激24小时后的胸腺细胞离心，并用无血清DMEM培养基洗涤细胞沉淀三次，收集第三次洗涤培养基做对照培养基。无血清DMEM培养基重悬胸腺细胞，继续培养48小时，离心取上清做诱导培养基。将NRK52E细胞分为对照组和诱导组，两组细胞的孵育条件分别为：45%DMEM培养基+45%对照培养基+10%FBS和45%DMEM培养基+45%诱导培养基+10%FBS。于诱导后24小时在倒置相差显微镜下观察细胞形态，用RT-PCR法、免疫细胞化学染色和免疫荧光染色检测NRK52E细胞的转分化状态。另外通过划痕实验观察诱导后NRK52E细胞迁移能力的改变。 结果：经过ConA和PHA联合刺激24小时后，胸腺细胞体积增大，直径由14.00±1.2μm增加至20.36±2.1μm（P0.05），细胞增殖指数也由对照组的19.23％±2.37％增加至刺激组的27.45%±1.77％（P0.05）。刺激48小时后胸腺细胞分泌干扰素-γ的量由633.5±18.3pg/ml升高至791±26.7pg/ml（P0.05），而IL-2的分泌量在刺激24、48和72小时后，分别由4352.65±67.1pg/ml、4241.5±56.2pg/ml、4673.5±87.9pg/ml升高至5531.79±40.2pg/ml、5267.45±31.7pg/ml、5387.1±89.2pg/ml，（P0.05）。以上结果提示，ConA和PHA的联合刺激促进了胸腺细胞的增殖、活化和细胞因子的分泌。形态观察发现，经过诱导培养基诱导24小时后，诱导组NRK52E细胞变为间充质细胞样的长梭形，细胞间隙变大，排列稀疏。RT-PCR结果显示，诱导后NRK52E细胞E-Ca表达下降，mRNA的相对表达量由0.764±0.032下降至0.214±0.025（P0.05）;而α-SMA表达升高，mRNA的相对表达量由0.56±0.031升高至0.647±0.021（P0.05）。此外免疫细胞化学染色和免疫荧光染色均发现，诱导后NRK52E细胞上皮细胞标记物E-Ca和CK-19表达下降而间充质细胞标记物α-SMA和Vimentin表达升高。划痕试验还发现，诱导后NRK52E细胞迁移能力增加，相对迁移率由对照组的62.1%±6.0%增加至诱导组的83.0%±2.8%（P0.05）。 结论：大鼠胸腺细胞能诱导体外培养的肾小管上皮细胞发生上皮-间充质细胞转分化，且转分化后的肾小管上皮细胞的体外迁移能力增加。