检索结果-南通市图书馆

作者：陈洋中国人民解放军空军军医大学

学位级别：硕士

森林脑炎病毒又称蜱传脑炎病毒(Tick-borne encephalitis virus,TBEV),经蜱虫传播,可引起以急性中枢神经系统病变为特征的森林脑炎(Tick-borne encephalitis,TBE)(又称为俄罗斯春夏脑炎)。每年全球报道的森林脑炎病例超过10000例,主要... 详细信息

森林脑炎病毒又称蜱传脑炎病毒(Tick-borne encephalitis virus,TBEV),经蜱虫传播,可引起以急性中枢神经系统病变为特征的森林脑炎(Tick-borne encephalitis,TBE)(又称为俄罗斯春夏脑炎)。每年全球报道的森林脑炎病例超过10000例,主要流行于东欧、北欧、俄罗斯,我国东北和西北林区也有流行。TBEV致死率较高且伴有长期的神经精神后遗症,目前尚无特异性治疗药物。因此,TBEV感染是严重的公共卫生问题之一。TBEV基因组为单股正链RNA,其开放读码框(Open reading frame,ORF)编码3种结构蛋白(C、Pr M、E)和7种非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)。其中包膜蛋白E与宿主细胞受体结合介导病毒入胞,可诱导机体产生保护性中和抗体,是疫苗的主要抗原成分,也是血清学诊断的主要靶标。E蛋白主要四个结构域组成,DⅠ、DⅡ和DⅢ三个结构域构成了E蛋白胞外区(Envelope ectodomain,Eecto),DⅣ为茎区和跨膜锚定区。Eecto暴露于病毒表面,在胰蛋白酶处理病毒粒子后可脱落,也称为可溶性E蛋白(souble Envelope,s E),其晶体结构与完整病毒颗粒E蛋白基本一致,含有E蛋白几乎所有的抗原表位。结构蛋白Pr ME在细胞中表达后可形成病毒样颗粒(virus like particle,VLP),与病毒具有相似的空间结构,将其转染复制子细胞后制备的报告病毒颗粒(Reporter virus particle,RVP)可用于血清及抗体的中和活性评价。本研究以我国主要流行的TBEV森张株为对象,首先化学合成密码子优化的Eecto序列,构建原核表达载体进行表达与纯化,纯化蛋白免疫小鼠评价血清抗体活性;采用杂交瘤技术制备Eecto单克隆抗体,分别从效价、特异性及交叉反应性评价Eecto特异性单克隆抗体;最后以实验室构建的黄热病毒复制子稳转细胞系为基础制备含有报告基因的TBEV-RVP,对获得的单克隆抗体进行中和活性评价。相关研究方法及结果:1.TBEV-E蛋白胞外区的原核表达、纯化及免疫原性鉴定;首先从Genbank数据库检索TBEV森张株的基因序列,选择Eecto序列并进行大肠杆菌密码子优化和化学合成。将Eecto基因克隆入原核表达载体p ET28a中构建重组质粒p ET28a-TBEV-Eecto。重组质粒经PCR鉴定,扩增出了分子量约为1,200bp的特异性条带,与理论大小一致;双酶切后的条带,符合预期大小;测序结果显示Eecto序列无误。其次将p ET28a-TBEV-Eecto转化BL21感受态,经1 m M/L IPTG小量诱导表达,SDS-PAGE显示Eecto蛋白以包涵体的形式表达;大量诱导表达后离心收集菌体提取包涵体,经6M盐酸胍(Gua-HCl)溶解后在复性缓冲液作用下获得可溶性蛋白,后者经超滤及Ni预装柱亲和层析纯化,最后再经超滤去除咪唑,SDS-PAGE分析显示获得纯度较高的TBEV-Eecto蛋白,利用组氨酸标签抗体进行蛋白印迹试验(Western blotting,Western blot),结果显示目的条带特异,与预期大小一致。为鉴定TBEV-Eecto的免疫原性,取20μg TBEV-Eecto蛋白与佐剂混合后肌肉接种免疫小鼠。第3周后以同样方式加强免疫1次,第5周后鼠尾采血。以TBEV-Pr ME真核表达质粒转染的293T细胞为对象,利用上述免疫血清做为一抗进行免疫印迹(Western blot)和免疫荧光测定(Immunofluorescence assay,IFA)实验。Western blot结果显示特异条带与TBEV-E蛋白大小一致,IFA结果显示在表达了TBEV-Pr ME的细胞存在特异性绿色荧光。该结果表明TBEV-Eecto蛋白免疫的小鼠血清能够识别真核表达的E蛋白,提示Eecto蛋白具有良好的免疫原性。2.TBEV-E蛋白胞外区的单克隆抗体制备及初步评价为制备Eecto的单克隆抗体,利用间接ELISA法测定上述Eecto蛋白免疫小鼠血清,选取免疫血清经1:1000稀释后的OD最高的2只小鼠分离脾细胞。将脾细胞和小鼠骨髓瘤Sp2/0细胞以PEG 1500为促融剂进行融合,融合后先后经HAT和HT培养基选择性培养,利用间接ELISA法测定杂交瘤细胞上清的效价,选取效价较高的细胞孔进行有限稀释法克隆化,经过4次克隆化得到稳定表达Eecto蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞,共6株。抗体亚类分型显示,2H8H4和2E3G6的抗体亚型为Ig G1型,而3C5D4、4H10D4、4H3B11、2B11H4均为Ig G2b型,6株单克隆抗体的轻链均为к链。随后将6株细胞分别注射石蜡油预处理过的BALB/c小鼠,制备腹水后检测效价,结果显示有4株单抗效价可达1:10,2株仅为1:

关键词： TBEV E蛋白胞外区原核表达单克隆抗体报告病毒颗粒

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盘状结构域受体2胞外区的可溶性表达、纯化和功能鉴定

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Acta Biochimica et Biophysica Sinica 2001年第6期33卷 647-652页

作者：王吉村刘新平聂晓燕吴国强张文红沈岚药立波第四军医大学生物化学与分子生物学教研室

盘状结构域受体 2 (discoidindomainreceptor 2 ,DDR2 )是一种与肿瘤细胞转移相关的蛋白酪氨酸激酶 ,其配体为纤维性胶原 ,胶原对DDR2的活化上调细胞中基质金属蛋白酶 1(MMP 1)的表达。为研究DDR2在类风湿性关节炎 (rheumatoidarthritis... 详细信息

盘状结构域受体 2 (discoidindomainreceptor 2 ,DDR2 )是一种与肿瘤细胞转移相关的蛋白酪氨酸激酶 ,其配体为纤维性胶原 ,胶原对DDR2的活化上调细胞中基质金属蛋白酶 1(MMP 1)的表达。为研究DDR2在类风湿性关节炎 (rheumatoidarthritis ,RA)软骨破坏和肿瘤转移中的作用 ,尝试了在大肠杆菌中表达一段DDR2胞外区(命名DB) ,并进行了可溶性部分的纯化和功能鉴定 ,以备将来用作DDR2的特异性阻断剂。获得了一株表达GST DB融合蛋白的大肠杆菌克隆 ;其表达的蛋白质中可溶性部分约占全部融合蛋白的 13% ;经GST融合蛋白特异性亲和珠纯化后 ,获得了纯度约 86 .1%的可溶性GST DB融合蛋白 ;竞争结合抑制实验显示 ,GST DB具有阻断II型胶原和细胞表面天然DDR2受体结合的功能 ;细胞实验表明 ,GST DB有抑制II型胶原刺激下的类风湿性关节炎滑膜细胞和NIH 3T3细胞分泌MMP 1的作用。以上结果提示 ,表达的融合蛋白GST DB具有抑制天然DDR2功能的作用 ;DDR2在滑膜细胞和NIH 3T3细胞中介导II型胶原刺激下的MMP 1的分泌。

关键词：盘状结构域受体2 胞外区表达阻断剂基质金属蛋白酶1

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人表皮生长因子受体Ⅲ型突变体胞外区的克隆表达和鉴定

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南方医科大学学报 2008年第2期28卷 151-153页

作者：张兴梅石玉生刘忠英南方医科大学基础医学院神经生物教研室广东广州510515 南方医科大学南方医院放疗科广东广州510515 南方医科大学基础医学院组织和胚胎学教研室广东广州510515

目的构建含表皮生长因子(EGF)受体Ⅲ型突变体胞外区基因(vⅢECD)的重组质粒并进行表达和鉴定。方法应用PCR方法扩增EGFRvⅢ ECD片段,将其T-A克隆和测序,再将目的基因插入GST融合表达载体pGEX-4T-1中进行表达。采用双酶切鉴定插入序列的... 详细信息

目的构建含表皮生长因子(EGF)受体Ⅲ型突变体胞外区基因(vⅢECD)的重组质粒并进行表达和鉴定。方法应用PCR方法扩增EGFRvⅢ ECD片段,将其T-A克隆和测序,再将目的基因插入GST融合表达载体pGEX-4T-1中进行表达。采用双酶切鉴定插入序列的正确性,用SDS-PAGE及Western blotting分析融合蛋白的表达。结果测序结果证实插入DNA序列与EGFR胞外区序列完全一致;双酶切鉴定表明,EGFRvⅢ ECD序列已经正确克隆到GST融合表达载体中。SDS-PAGE电泳显示融合蛋白在E.coli BL21(DE3)中以包涵体形式表达,重组融合蛋白GST-vⅢECD的表达量占菌体总蛋白的15%以上。Western blotting分析证实重组融合蛋白可以被EGFR特异性抗体所识别。结论成功构建了融合表达载体(pGEX-4T-1/vⅢECD),并进行了融合蛋白的诱导表达和鉴定,可进一步用于EGFRvⅢ功能及免疫学研究。

关键词：表皮生长因子受体 Ⅲ型突变体胞外区原核表达融合蛋白

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森林脑炎病毒包膜糖蛋白胞外区的表达、纯化及免疫原性分析

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空军军医大学学报 2023年第6期44卷 536-540页

作者：陈洋张剑陈华薛潘武福星袁明城袁若栋董阳超叶伟叶传涛雷迎峰空军军医大学基础医学院微生物与病原生物学教研室陕西西安710032 空军军医大学唐都医院妇产科陕西西安710038 空军军医大学唐都医院传染科陕西西安710038

目的构建森林脑炎病毒(TBEV)森张株包膜糖蛋白E胞外区的原核表达质粒,并在大肠埃希菌中诱导表达、纯化及初步分析其免疫原性。方法从GenBank下载TBEV森张株E蛋白胞外区基因序列(Eecto),密码子优化后交由公司合成,通过双酶切的方法克隆至... 详细信息

目的构建森林脑炎病毒(TBEV)森张株包膜糖蛋白E胞外区的原核表达质粒,并在大肠埃希菌中诱导表达、纯化及初步分析其免疫原性。方法从GenBank下载TBEV森张株E蛋白胞外区基因序列(Eecto),密码子优化后交由公司合成,通过双酶切的方法克隆至pET28a载体,获得重组质粒pET28a-TBEV-Eecto。经过酶切和测序分析后,将正确的重组质粒转化BL21(DE3)感受态,用1 mmol/L异丙基-β-D-硫化半乳糖苷诱导表达后通过SDS-PAGE分析重组E蛋白胞外区的表达形式。纯化的包涵体用6 mol/L盐酸胍进行变性溶解,用含有非表面活性剂NDSB-201的缓冲液进行复性,之后超滤浓缩、镍柱亲和层析纯化及蛋白印迹鉴定。将获得的纯化TBEV-Eecto蛋白免疫BALB/c小鼠,利用免疫血清进行蛋白印迹、免疫荧光实验分析其特异性。结果重组质粒pET28a-TBEV-Eecto经酶切后的片段与预期大小一致,测序分析正确。重组蛋白TBEV-Eecto主要以包涵体形式表达,经过盐酸胍变性溶解、NDSB-201复性、超滤及镍柱亲和纯化后获得纯化蛋白,SDS-PAGE和Western blotting分析均显示其与预期大小一致。纯化的TBEV-Eecto蛋白免疫小鼠血清可特异性识别真核表达的TBEV-PrME蛋白,提示TBEV-Eecto具有良好的免疫原性。结论成功构建TBEV森张株E蛋白胞外区的原核表达质粒并在大肠杆菌中表达。纯化的TBEV-Eecto蛋白具有较好的免疫原性,为森林脑炎的血清学诊断方法和亚单位疫苗研制提供了基础。

关键词：森林脑炎病毒包膜蛋白胞外区原核表达免疫原性

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小鼠可溶性IL-5受体α胞外区基因的克隆及原核表达

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中国生物制品学杂志 2009年第4期22卷 327-330页

作者：宋爱玲蔡累杨怡王伟华王增禄张英起李志奎第四军医大学西京医院西安710032 第四军医大学生物技术中心西安710032

目的克隆并原核表达小鼠可溶性IL-5受体α(sIL-5Rα)胞外区基因。方法采用RT-PCR从BALB/c小鼠脾脏组织中分别扩增sIL-5Rα胞外区前后段基因片段,酶切后将两段基因连接,插入原核表达载体pPROEX中,构建重组表达质粒pPROEX/sIL-5Rα,转化... 详细信息

目的克隆并原核表达小鼠可溶性IL-5受体α(sIL-5Rα)胞外区基因。方法采用RT-PCR从BALB/c小鼠脾脏组织中分别扩增sIL-5Rα胞外区前后段基因片段,酶切后将两段基因连接,插入原核表达载体pPROEX中,构建重组表达质粒pPROEX/sIL-5Rα,转化大肠杆菌DH5α,IPTG诱导表达。采用SDS-PAGE和Western blot检测目的蛋白的表达。结果重组表达质粒经双酶切和DNA测序,证实构建正确。表达的sIL-5Rα胞外区蛋白相对分子质量约36100,表达量约占菌体总蛋白的30%,且可与兔抗小鼠sIL-5Rα单抗发生特异性免疫反应。结论已成功克隆并原核表达了小鼠sIL-5Rα胞外区基因,为进一步探讨sIL-5Rα对哮喘的治疗作用及开发新的哮喘治疗药物奠定了基础。

关键词：可溶性IL-5受体α 胞外区克隆原核表达

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牛疱疹病毒1型gE蛋白胞外区基因的杆状病毒表达及其表达产物的免疫反应性

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中国兽医科学 2014年第9期44卷 915-920页

作者：姜良黄秀芬王天坤刘杉杉李永清北京市农林科学院畜牧兽医研究所畜禽疫病防控技术北京市重点实验室北京100097 吉林农业大学生物学院吉林长春130118 昌平区动物疫病预防控制中心北京102200

为获得具有生物学活性的牛疱疹病毒1型(BHV 1)囊膜糖蛋白gE,采用PCR方法从BHV 1感染的牛肾细胞全基因组中扩增出约1.7kb的gE基因,再将1 176bp的gE胞外区基因片段克隆到新型杆状病毒载体pFastBac-LIC-Bse中,构建重组转移质粒pFB-gE。将pF... 详细信息

为获得具有生物学活性的牛疱疹病毒1型(BHV 1)囊膜糖蛋白gE,采用PCR方法从BHV 1感染的牛肾细胞全基因组中扩增出约1.7kb的gE基因,再将1 176bp的gE胞外区基因片段克隆到新型杆状病毒载体pFastBac-LIC-Bse中,构建重组转移质粒pFB-gE。将pFB-gE转化到杆状病毒基因组的DH10Bac感受态细胞中,制备重组杆粒rBacmid-gE。将该重组杆粒的DNA转染昆虫细胞Sf9,获得与gE基因发生重组的杆状病毒。Western-blot分析及间接免疫荧光试验(IFA)的结果显示,重组杆状病毒在Sf9中表达了分子质量大小约为43ku的gE融合蛋白,该融合蛋白分别与小鼠抗His标签单克隆抗体和小鼠抗BHV 1多克隆抗体发生特异性结合,表明获得的gE融合蛋白具有良好的免疫反应性。本研究为进一步获得高特异性的诊断抗原奠定了基础。

关键词：牛疱疹病毒1型 gE基因胞外区杆状病毒表达

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肿瘤相关抗原Trop-2胞外区片段蛋白的表达及其特性分析

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南京医科大学学报（自然科学版） 2010年第3期30卷 312-315页

作者：林红张慧林梁洁朱进唐奇苏亦平冯振卿管晓红南京医科大学卫生部抗体技术重点实验室江苏南京210029 南京医科大学附属南京市妇幼保健院江苏南京210029 南京军区军事医学研究所江苏南京210002

目的:从临床乳腺癌组织中扩增肿瘤相关抗原Trop-2胞外肽段基因,在大肠杆菌中表达重组蛋白,并对该蛋白的生物学特性进行鉴定。方法:RT-PCR扩增Trop-2胞外肽段基因并克隆于pMD18-T载体中进行测序分析,用NcoⅠ和EcoRⅠ将含Trop-2胞外区重... 详细信息

目的:从临床乳腺癌组织中扩增肿瘤相关抗原Trop-2胞外肽段基因,在大肠杆菌中表达重组蛋白,并对该蛋白的生物学特性进行鉴定。方法:RT-PCR扩增Trop-2胞外肽段基因并克隆于pMD18-T载体中进行测序分析,用NcoⅠ和EcoRⅠ将含Trop-2胞外区重组基因的质粒双酶切后,克隆到pBAD-gⅢ中。重组质粒经酶切鉴定、核酸序列分析后转化大肠杆菌TOP10,以L-阿拉伯糖诱导表达融合蛋白,表达的蛋白经后His柱亲和层析纯化后,用Western blot、ELISA检测鉴定。结果:重组表达质粒经酶切鉴定为阳性,核酸序列分析正确。SDS-PAGE和Western blot显示,表达的重组蛋白分子质量约为38ku,此抗原能够与商业化抗体特异性结合。结论:成功制备Trop-2胞外区重组基因表达的蛋白,并证明原核表达的Trop-2胞外肽段保持了原有的抗原性。

关键词： Trop-2基因胞外区原核表达

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猪TLR3胞外区片段重组载体的构建、表达和多克隆抗体的制备

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甘肃农业大学学报 2012年第3期47卷 1-6,12页

作者：管齐赛房永祥贾怀杰何小兵周涛杨孝朴景志忠甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730050 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点实验室甘肃兰州730046

为制备猪TLR3(poTLR3)胞外区蛋白的多克隆抗体,从poTLR3克隆载体扩增胞外区基因序列连接到pGEX-4T-1载体上,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下,表达GST-poTLR3融合蛋白,将表达的融合蛋白纯化,免疫家兔制备抗体,并以间接ELISA法测定... 详细信息

为制备猪TLR3(poTLR3)胞外区蛋白的多克隆抗体,从poTLR3克隆载体扩增胞外区基因序列连接到pGEX-4T-1载体上,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下,表达GST-poTLR3融合蛋白,将表达的融合蛋白纯化,免疫家兔制备抗体,并以间接ELISA法测定抗体效价,利用Western-blot和细胞免疫荧光验证抗体与真核表达蛋结合的白特异性.结果表明:制备的多克隆抗体的效价可达1∶128 000,poTLR3胞外区蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,并且制备的多克隆抗体特异性好、滴度高.

关键词：猪TLR3 胞外区原核表达多克隆抗体

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卵泡刺激素功能肽与受体胞外区不同片段结合作用的分析

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新疆农业科学 2017年第7期54卷 1284-1290页

作者：赵婷席欧彦秦瑞坪邱玲玲马晓玲李江伟新疆大学生命科学与技术学院新疆生物资源基因工程重点实验室乌鲁木齐830046

【目的】卵泡刺激素(FSH)33-53肽可以与FSH受体(FSHR)结合,并激活下游信号,被作为FSH功能肽。然而其在受体上的具体结合位置还不清楚。阐明FSH33-53肽在FSHR上的结合区域,为基于FSH的疫苗设计提供依据。【方法】采用重组的FSHR胞外区(E... 详细信息

【目的】卵泡刺激素(FSH)33-53肽可以与FSH受体(FSHR)结合,并激活下游信号,被作为FSH功能肽。然而其在受体上的具体结合位置还不清楚。阐明FSH33-53肽在FSHR上的结合区域,为基于FSH的疫苗设计提供依据。【方法】采用重组的FSHR胞外区(ECD)和富含亮氨酸区(LRR)及合成的FSHR9-30区分析这些FSHR的功能区域与FSH33-53的结合作用。PCR扩增得到h FSHR ECD和h FSHR LRR目的基因,构建重组质粒p ET22b-FSHR-ECD和p ET22b-FSHR-LRR,表达纯化获得蛋白FSHR-ECD和FSHR-LRR。采用多肽合成法获得FSHR9-30-KLH。通过ELISA方法检测受体片段与FSH33-53肽的结合和亲和力。【结果】获得FSHR-ECD和FSHR-LRR蛋白,其相对分子质量(Mr)分别为43和32k Da。在受体为0.5μgm L,配体为2.5μgm L时,三种蛋白均与FSH33-53肽结合。ELISA检测受体与配体的亲和力分别为0.21×10^(-6)、0.45×10^(-6)和0.056×10^(-6)mol/L。【结论】FSHR 9-30片段与FSH33-53肽的结合较其它两个片段结合力强。

关键词： FSH33-53肽 LRR FSHR9-30肽胞外区亲和力

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代谢型谷氨酸受体mGluR7的基因组结构及其家族蛋白胞外区的基因组结构比较

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科学通报 2002年第7期47卷 508-515页

作者：吴清发董伟包维东牛宇欣张以琳张海清杨焕明齐晓华陈冲刘斌胡松年汪建中国科学院遗传研究所人类基因组中心北京100101 北京华大基因研究中心北京100300

L-谷氨酸是哺乳动物中枢神经系统中的神经递质,其代谢型谷氨酸受体mGluR7在正常中枢神经功能和多种神经退行性疾病的病理发生中起着重要作用.为了研究mGluR7基因相关疾病的生物和遗传基础,通过从BAC文库中筛选种子克隆和对酶切指纹图谱... 详细信息

L-谷氨酸是哺乳动物中枢神经系统中的神经递质,其代谢型谷氨酸受体mGluR7在正常中枢神经功能和多种神经退行性疾病的病理发生中起着重要作用.为了研究mGluR7基因相关疾病的生物和遗传基础,通过从BAC文库中筛选种子克隆和对酶切指纹图谱数据库查询等方法,构建了覆盖mGluR7全长基因的基因组物理图谱,并采用鸟枪法策略对图中BAC克隆进行测序与拼接组装,最终得到准确度为万分之一的完整的基因组序列.序列分析表明:mGluR7基因是长达880 kb的超大基因;其基因组 GC含量为 38％,重复序列含量为 37.5％;由 11个外显子和 10个内含子组成,其中5个内含子长度超过100 kb,内含子1长达285 kb;存在2个替换剪接转录本mGluR7a和mGluR7b.通过比较mGluR基因家族3组8个亚型受体蛋白胞外区的基因组结构,发现它们对应的基因组结构分为3组,组内各成员的基因组结构较为保守,而组间各成员的基因组结构保守性较差.这种基因组水平的组内保守和组间差异是和蛋白质水平上的保守和差异一致的,提示这些受体的基本功能在进化的过程中有明显的分化.在含mGluR7的组内,尽管组内各成员的基因组结构趋于保守,但大部分内含子长度变化幅度很大,揭示基因组结构变化的程度高于蛋白质水平的变化,这种变化预期是在基因表达的调控上体现其生物属性的.

关键词：代谢型丙氨酸受体 mGluR7 基因组结构家族蛋白胞外区

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