TBEV森张株E蛋白胞外区原核表达、纯化及单克隆抗体制备

作     者：陈洋 

作者单位：中国人民解放军空军军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：雷迎峰;叶传涛

授予年度：2023年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：TBEV E蛋白 胞外区 原核表达 单克隆抗体 报告病毒颗粒 

摘      要：森林脑炎病毒又称蜱传脑炎病毒(Tick-borne encephalitis virus,TBEV),经蜱虫传播,可引起以急性中枢神经系统病变为特征的森林脑炎(Tick-borne encephalitis,TBE)(又称为俄罗斯春夏脑炎)。每年全球报道的森林脑炎病例超过10000例,主要流行于东欧、北欧、俄罗斯,我国东北和西北林区也有流行。TBEV致死率较高且伴有长期的神经精神后遗症,目前尚无特异性治疗药物。因此,TBEV感染是严重的公共卫生问题之一。TBEV基因组为单股正链RNA,其开放读码框(Open reading frame,ORF)编码3种结构蛋白(C、Pr M、E)和7种非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)。其中包膜蛋白E与宿主细胞受体结合介导病毒入胞,可诱导机体产生保护性中和抗体,是疫苗的主要抗原成分,也是血清学诊断的主要靶标。E蛋白主要四个结构域组成,DⅠ、DⅡ和DⅢ三个结构域构成了E蛋白胞外区(Envelope ectodomain,Eecto),DⅣ为茎区和跨膜锚定区。Eecto暴露于病毒表面,在胰蛋白酶处理病毒粒子后可脱落,也称为可溶性E蛋白(souble Envelope,s E),其晶体结构与完整病毒颗粒E蛋白基本一致,含有E蛋白几乎所有的抗原表位。结构蛋白Pr ME在细胞中表达后可形成病毒样颗粒(virus like particle,VLP),与病毒具有相似的空间结构,将其转染复制子细胞后制备的报告病毒颗粒(Reporter virus particle,RVP)可用于血清及抗体的中和活性评价。本研究以我国主要流行的TBEV森张株为对象,首先化学合成密码子优化的Eecto序列,构建原核表达载体进行表达与纯化,纯化蛋白免疫小鼠评价血清抗体活性;采用杂交瘤技术制备Eecto单克隆抗体,分别从效价、特异性及交叉反应性评价Eecto特异性单克隆抗体;最后以实验室构建的黄热病毒复制子稳转细胞系为基础制备含有报告基因的TBEV-RVP,对获得的单克隆抗体进行中和活性评价。相关研究方法及结果:***-E蛋白胞外区的原核表达、纯化及免疫原性鉴定;首先从Genbank数据库检索TBEV森张株的基因序列,选择Eecto序列并进行大肠杆菌密码子优化和化学合成。将Eecto基因克隆入原核表达载体p ET28a中构建重组质粒p ET28a-TBEV-Eecto。重组质粒经PCR鉴定,扩增出了分子量约为1,200bp的特异性条带,与理论大小一致;双酶切后的条带,符合预期大小;测序结果显示Eecto序列无误。其次将p ET28a-TBEV-Eecto转化BL21感受态,经1 m M/L IPTG小量诱导表达,SDS-PAGE显示Eecto蛋白以包涵体的形式表达;大量诱导表达后离心收集菌体提取包涵体,经6M盐酸胍(Gua-HCl)溶解后在复性缓冲液作用下获得可溶性蛋白,后者经超滤及Ni预装柱亲和层析纯化,最后再经超滤去除咪唑,SDS-PAGE分析显示获得纯度较高的TBEV-Eecto蛋白,利用组氨酸标签抗体进行蛋白印迹试验(Western blotting,Western blot),结果显示目的条带特异,与预期大小一致。为鉴定TBEV-Eecto的免疫原性,取20μg TBEV-Eecto蛋白与佐剂混合后肌肉接种免疫小鼠。第3周后以同样方式加强免疫1次,第5周后鼠尾采血。以TBEV-Pr ME真核表达质粒转染的293T细胞为对象,利用上述免疫血清做为一抗进行免疫印迹(Western blot)和免疫荧光测定(Immunofluorescence assay,IFA)实验。Western blot结果显示特异条带与TBEV-E蛋白大小一致,IFA结果显示在表达了TBEV-Pr ME的细胞存在特异性绿色荧光。该结果表明TBEV-Eecto蛋白免疫的小鼠血清能够识别真核表达的E蛋白,提示Eecto蛋白具有良好的免疫原性。***-E蛋白胞外区的单克隆抗体制备及初步评价为制备Eecto的单克隆抗体,利用间接ELISA法测定上述Eecto蛋白免疫小鼠血清,选取免疫血清经1:1000稀释后的OD最高的2只小鼠分离脾细胞。将脾细胞和小鼠骨髓瘤Sp2/0细胞以PEG 1500为促融剂进行融合,融合后先后经HAT和HT培养基选择性培养,利用间接ELISA法测定杂交瘤细胞上清的效价,选取效价较高的细胞孔进行有限稀释法克隆化,经过4次克隆化得到稳定表达Eecto蛋白特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞,共6株。抗体亚类分型显示,2H8H4和2E3G6的抗体亚型为Ig G1型,而3C5D4、4H10D4、4H3B11、2B11H4均为Ig G2b型,6株单克隆抗体的轻链均为к链。随后将6株细胞分别注射石蜡油