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胞内分枝杆菌临床分离株耐药谱及基因型特征研究

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中华结核和呼吸杂志 2018年第7期41卷 539-543页

作者：王淑琦姜广路魏国梅霍凤敏董玲玲赵立平黄海荣王桂荣首都医科大学附属北京胸科医院北京市结核病胸部肿瘤研究所国家结核病临床实验室北京市耐药结核病研究重点实验室 101149

目的分析我国胞内分枝杆菌临床分离株的耐药谱及基因型特征，为治疗胞内分枝杆菌感染性疾病提供科学依据。方法纳入2013—2015年北京胸科医院150株胞内分枝杆菌临床分离株，采用微孔板Alamar Blue法测定胞内分枝杆菌对15种药物的最低抑... 详细信息

目的分析我国胞内分枝杆菌临床分离株的耐药谱及基因型特征，为治疗胞内分枝杆菌感染性疾病提供科学依据。方法纳入2013—2015年北京胸科医院150株胞内分枝杆菌临床分离株，采用微孔板Alamar Blue法测定胞内分枝杆菌对15种药物的最低抑菌浓度（MIC），以确定其药物的敏感度；对16个可变数目串联重复序列（VNTR）位点进行PCR扩增和产物电泳分析，使用BioNumerics软件对菌株进行聚类分析，以确定其基因型特征。使用SPSS 19.0软件对结果进行统计分析，应用χ2检验分析不同组间耐药率的差别。结果药敏试验结果显示，克拉霉素（97.3%，146/150）、莫西沙星（94.0%，141/150）和阿米卡星（90.0%，135/150）对胞内分枝杆菌具有较好的抗菌活性；75.3%（113/150）、64.0%（96/150）、52.7%（79/150）和8.7%（13/150）的菌株对利福平、利奈唑胺、卷曲霉素和乙胺丁醇敏感；3种注射类抗结核药物的MIC50与MIC90值为：阿米卡星4和16 mg/L，链霉素4和16 mg/L，卷曲霉素8和16 mg/L；5种氟喹诺酮类药物的MIC50与MIC90值为：莫西沙星0.5和2 mg/L，环丙沙星1和8 mg/L，左氧氟沙星1和8 mg/L，安妥沙星2和16 mg/L，氧氟沙星2和16 mg/L。采用16位点VNTR方法对胞内分枝杆菌进行基因分型，150株胞内分枝杆菌共分为21个簇，121种基因型，总Hunter－Gaston指数为0.997。结论克拉霉素、莫西沙星和阿米卡星在体外对胞内分枝杆菌具有较好的抗菌活性；16位点VNTR方法对胞内分枝杆菌临床分离株的分辨率较高；胞内分枝杆菌的耐药谱与菌株是否成簇并无明显相关性。

关键词：胞内分枝杆菌最低抑菌浓度抗药性基因型

胞内分枝杆菌HSP65基因克隆、分析及其原核表达的研究

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现代预防医学 2015年第3期42卷 515-518+532页

作者：葛淑敏王诚王准钱爱东长春理工大学生命科学技术学院吉林农业大学动物科学技术学院

目的克隆胞内分枝杆菌HSP 65基因,对其进行生物信息学分析与原核表达。方法应用巢式PCR克隆胞内分枝杆菌HSP 65基因,利用在线分析软件对其进行生物信息学分析。构建原核表达载体p ET 15b-HSP 65并进行诱导表达。结果胞内分枝杆菌HSP 65... 详细信息

目的克隆胞内分枝杆菌HSP 65基因,对其进行生物信息学分析与原核表达。方法应用巢式PCR克隆胞内分枝杆菌HSP 65基因,利用在线分析软件对其进行生物信息学分析。构建原核表达载体p ET 15b-HSP 65并进行诱导表达。结果胞内分枝杆菌HSP 65基因完整ORF基因全长1 626 bp,编码541个氨基酸。HSP 65蛋白为酸性、亲水性蛋白质,亚细胞定位主要存在于细胞质,蛋白二级结构以α-螺旋、无规则卷曲及β-折叠为主。使用同源建模法预测了HSP 65基因编码蛋白三维立体结构。试验构建p ET 15b-HSP 65原核表达载体并成功表达。结论成功克隆胞内分枝杆菌HSP 65基因,并对HSP 65蛋白进行了生物信息学分析及原核表达。

关键词：胞内分枝杆菌 HSP 65 克隆生物信息学分析原核表达

胞内分枝杆菌ELISA检测方法的建立及初步应用

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现代预防医学 2019年第9期46卷 1668-1671+1683页

作者：王康葛淑敏宋力强张家宁饶继红长春理工大学生命科学技术学院

目的建立胞内分枝杆菌双抗夹心ELISA检测胞内分枝杆菌生物学新方法。方法以自主制备的胞内分枝杆菌HBHA单克隆抗体为包被抗体,建立胞内分枝杆菌ELISA检测方法。应用棋盘法优化检测条件,同时试验对封闭液进行了最佳选择,对检测样品的特... 详细信息

目的建立胞内分枝杆菌双抗夹心ELISA检测胞内分枝杆菌生物学新方法。方法以自主制备的胞内分枝杆菌HBHA单克隆抗体为包被抗体,建立胞内分枝杆菌ELISA检测方法。应用棋盘法优化检测条件,同时试验对封闭液进行了最佳选择,对检测样品的特异性、敏感性和准确度进行评估。结果确定抗体包被最佳浓度为4μg/ml,抗鼠血清最佳稀释浓度为1:400,同时选择P/N值为3.38的1%BSA作为最佳封闭剂。双抗夹心法对新金分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、浅黄分枝杆菌和卡介苗等抗原检测的P/N值均小于2.1,无交叉反应。当菌体浓度为200个/ml时,检测结果仍为阳性,应用该方法检测60份样品中,呈现阳性的菌株为56份,检测准确度高达93.3%。结论本方法可作为胞内分枝杆菌快速检测和流行病学调查的工具,同时对畜牧业的健康发展提供一种新的技术保障。

关键词：胞内分枝杆菌酶联免疫法检测

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胞内分枝杆菌ELISA检测试剂盒的研制

胞内分枝杆菌ELISA检测试剂盒的研制

作者：宋力强长春理工大学

学位级别：硕士

肝素结合血凝素(HBHA)是分枝杆菌分泌的一种黏附素,它是由致病性分枝杆菌产生的一种糖蛋白,肺外播散性结核重要毒力因素之一。HBHA在胞内分枝杆菌免疫诊断、治疗和预防方面的应用研究起重要意义。本文将构建好的pET-32a-HBHA质粒转入到B... 详细信息

肝素结合血凝素(HBHA)是分枝杆菌分泌的一种黏附素,它是由致病性分枝杆菌产生的一种糖蛋白,肺外播散性结核重要毒力因素之一。HBHA在胞内分枝杆菌免疫诊断、治疗和预防方面的应用研究起重要意义。本文将构建好的pET-32a-HBHA质粒转入到BL21(DE3)中,在诱导剂IPTG作用下表达HBHA蛋白。经组氨酸镍柱纯化浓缩,SDS-PAGE电泳鉴定,获得约38 kDa大小,浓度为1.6 mg/ml的HBHA蛋白。应用单克隆抗体技术,以纯化的胞内分枝杆菌HBHA蛋白为免疫抗原制备抗胞内分枝杆菌HBHA单克隆抗体,得到三株细胞上清效价为1:1600的细胞株,体内扩大培养后,获得大量效价为2.56×10的抗体。并以HBHA单克隆抗体作为包被抗体建立胞内分枝杆菌ELISA检测方法。应用棋盘法优化检测条件,同时试验对封闭液进行了最佳选择,对检测样品的特异性、敏感性和准确度进行评估,评估结果显示,该法对其他抗原均无交叉反应,有良好的特异性,能检测菌体浓度为200个/ml,具有良好的敏感性,检测准确度高达93.3%,并成功组装试剂盒。该试剂盒对家畜胞内分枝杆菌病的诊断和防治具有重要的现实意义,具有广阔的发展前景和巨大的市场需求。

关键词：胞内分枝杆菌肝素结合血凝素单克隆抗体技术酶联免疫法试剂盒

胞内分枝杆菌HSP65基因和HSP70基因的克隆及原核表达

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胞内分枝杆菌HSP65基因和HSP70基因的克隆及原核表达

作者：任梅吉林农业大学

学位级别：硕士

胞内分枝杆菌(mycobacteria intracellular)是非结核分枝杆菌中的一种特殊的细菌。主要引致病患慢性肺部感染,儿童病患主要是被引致淋巴结炎。然且胞内分枝杆菌通常容易同艾滋病(AIDS)一起呈现为播散感染,因此,免疫抑制病患亦可被该菌... 详细信息

胞内分枝杆菌(mycobacteria intracellular)是非结核分枝杆菌中的一种特殊的细菌。主要引致病患慢性肺部感染,儿童病患主要是被引致淋巴结炎。然且胞内分枝杆菌通常容易同艾滋病(AIDS)一起呈现为播散感染,因此,免疫抑制病患亦可被该菌侵袭。科研人员发现,发生针对于分枝杆菌而诱生的免疫效应中,热休克蛋白(HSP)是被T细胞最主要攻击的对象。有文献报道,大概有20种左右的感染性疾病能够针对于HSP以诱生免疫反应,调查以后发现以HSP60家族为最多。分枝杆菌被诱生免疫交叉反应时,相较于其他HSP来言,HSP65所具备有的保护性更强。分枝杆菌HSP70亦具备有很强大的免疫原性,其能够诱生出强烈的细胞反应。目前,针对于胞内分枝杆菌的研究处初级阶段,对于胞内分枝杆菌的HSP的研究亦很少。因此,本论文对于实验室已冻存的胞内分枝杆菌((?)NTCC13950株)选取HSP65基因、HSP70基因做原核表达。本研究采用巢氏PCR,各自设计外引物、内引物两套引物以进行扩增。首先以胞内分枝杆菌(ATCC13950株)基因组DNA做模板,采用其HSP65基因、HSP70基因各自的外引物以进行扩增而获取外扩片段。在纯化其PCR产物过后,本实验再各自以HSP65基因、HSP70基因的外扩片段做模板,采用其各自相对应的内引物以进行扩增而获取内扩片段。纯化其PCR产物过后,其各自同PMD18-T载体连接,构建成PMD18-T-HSP65、 PMD18-T-HSP70重组克隆质粒。其各自转化大肠杆菌DH5α,置放37℃下以进行培养55min,过后涂布LB(Amp+)琼脂平板,置37℃倒置培养15h。任取各自平板上长有的白色菌落,各自接种到LB(Amp+)液体培养基,置37℃下以震荡培养13h。吸出3m1菌液以被用于提质粒,过后经由PCR鉴定、Nde Ⅰ, BamH Ⅰ双酶切鉴定。对鉴定正确的送生工生物(上海)公司以测序。结果发现胞内分枝杆菌(ATCC13950株)HSP65基因序列、HSP70基因序列同Genebank里该两序列的同源性分别是99.88%、99.95%。其后,本实验分别对PMD18-T-HSP65、PMD18-T-HP70阳性重组克隆质粒以进行NdeⅠ, BamH Ⅰ双酶切,胶回收。过后克隆至经由相同方法被处理过的PET15b载体上。其各自转化大肠杆菌DH5α,培养后以被用于提质粒。PCR、双酶切鉴定以筛选PET15b-HSP65、PET15b-HSP70阳性重组表达质粒。二者重组表达质粒各自转化大肠杆菌BL21(DE3)plyss,培养过后各自吸出100μL菌液以分别接入10ml LB(Amp+)培养液。先置放37℃培养1.5h,再置放37℃,经由终浓度达0.8mmol/L IPTG诱导4.5h。SDS-PAGE分析各自的表达产物。结果显示胞内分枝杆菌(ATCC13950株)HSP65基因、HSP70基因均得良好的表达,该菌其重组表达的HSP65蛋白显示分子量约在65kD大小,本菌其重组表达的HSP70蛋白约在70kD大小。Western blot检测证明,原核表达的胞内分枝杆菌(ATCC13950株)HSP65蛋白、HSP70蛋白均同胞内分枝杆菌阳性血清发生反应,证明此两蛋白其反应原性均良好。即在临床研究中能够被利用,这亦为胞内分枝杆菌及其HSP65、HSP70以后更深层次的科研工作提供以技术依据。

关键词：胞内分枝杆菌分子克隆原核表达鉴定

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豚鼠感染模型评价胞内分枝杆菌毒力的研究

中国人兽共患病学报 2024年

作者：李光何杏许达李贞卢坤鹏王萍袁昱珍李马超刘海灿万康林岳阳职业技术学院岳阳新华达制药有限公司传染病溯源预警与智能决策全国重点实验室中国疾病预防控制中心传染病预防控制所

目的建立豚鼠感染模型，评价胞内分枝杆菌的毒力，为预防与治疗胞内分枝杆菌感染提供科学依据。方法培养胞内分枝杆菌CHPC1.5701，菌悬液用0.9%氯化钠溶液分别稀释至1×1010CFU/mL、1×109CFU/mL、1×108CFU/mL、1×107CFU/mL和1×106CF... 详细信息

目的建立豚鼠感染模型，评价胞内分枝杆菌的毒力，为预防与治疗胞内分枝杆菌感染提供科学依据。方法培养胞内分枝杆菌CHPC1.5701，菌悬液用0.9%氯化钠溶液分别稀释至1×1010CFU/mL、1×109CFU/mL、1×108CFU/mL、1×107CFU/mL和1×106CFU/mL。筛选结核菌素纯蛋白衍生物皮肤试验呈阴性的健康Hartly豚鼠，随机分为6组，每组10只，雌雄各半。实验组豚鼠5组，分别腹腔注射5种不同浓度菌悬液1.0mL/只，对照组豚鼠腹腔注射0.9%氯化钠溶液1.0mL/只。观察豚鼠一般表现，每周称重，5周后解剖，取肺、脾、肝组织，分析组织病变及荷菌量。结果攻毒试验对雄性豚鼠体重无显著性影响（P>0.05），可使雌性豚鼠体重减轻（P胞浸润，肉芽肿性炎等，病变程度与攻毒剂量有关。部分脏器组织培养可分离到胞内分枝杆菌，其中脾脏荷菌量较大。结论腹腔注射胞内分枝杆菌CHPC 1.5701可影响雌性豚鼠体重，造成肺脏、肝脏、脾脏感染和病变，对豚鼠具有一定的毒力，属于低毒力、低致病性细菌。

关键词：胞内分枝杆菌豚鼠感染模型毒力评价

鸟-胞内分枝杆菌复合群鸟和胞内分枝杆菌亚种对20种药物的敏感性特征及亚种间药物敏感性比较

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中国人兽共患病学报 2020年第6期36卷 448-455页

作者：肖士林赵秀芹刘志广刘海灿李马超蒋毅赵丽丽李桂莲万康林中国疾病预防控制中心传染病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室感染性疾病诊治协同创新中心北京102206

目的分析鸟-胞内分枝杆菌复合群鸟分枝杆菌亚种和胞内分枝杆菌亚种对20种药物的敏感性特征及比较2个亚种间的药物敏感性差异。方法用微孔板Alamar blue显色法分别检测97株鸟分枝杆菌和172株胞内分枝杆菌对克拉霉素、卷曲霉素和利福布丁... 详细信息

目的分析鸟-胞内分枝杆菌复合群鸟分枝杆菌亚种和胞内分枝杆菌亚种对20种药物的敏感性特征及比较2个亚种间的药物敏感性差异。方法用微孔板Alamar blue显色法分别检测97株鸟分枝杆菌和172株胞内分枝杆菌对克拉霉素、卷曲霉素和利福布丁等20种药物的最小抑菌浓度,判断其敏感性,分析2个亚种菌株对20种药物的敏感性特征以及对利福霉素类、氨基糖苷类和大环内酯类内药物的交叉耐药性,并比较2个亚种对20种药物的敏感性差异。结果对鸟分枝杆菌敏感率高于80%的药物依次是卷曲霉素(100%,97/97)、阿米卡星(97.9%,95/97)、利福布丁(96.9%,94/97)、利福平和卡那霉素(83.5%,81/97)及克拉霉素(82.5%,80/97);对胞内分枝杆菌敏感率高于80%的药物依次是阿米卡星(99.4%,171/172)、卡那霉素(95.9%,165/172)、利福布丁(95.4%,164/172)、克拉霉素(94.2%,162/172)、氯法齐明(87.2%,150/172)、卷曲霉素和罗红霉素(86.1%,148/172)及利福喷丁(82.6%,142/172)。97株鸟分枝杆菌分别有1株、1株和17株而172株胞内分枝杆菌中分别有0株、7株和6株同时对氨基糖苷类、利福霉素类和大环内酯类内各种药物同时耐药或中度敏感。鸟分枝杆菌对利福平和卷曲霉素的敏感率明显高于胞内分枝杆菌。胞内分枝杆菌对利福喷丁、妥布霉素、卡那霉素、乙胺丁醇、莫西沙星、克拉霉素、阿奇霉素和罗红霉素的敏感率均高于鸟分枝杆菌。结论鸟和胞内分枝杆菌均对卷曲霉素、阿米卡星、利福布丁和克拉霉素敏感性较高,对胞内分枝杆菌敏感的药物多于鸟分枝杆菌,利福喷丁仅对胞内分枝杆菌抗菌性较好,而利福平仅对鸟分枝杆菌抗菌性较好,乙胺丁醇对两个亚种敏感性均较差;对同一种类的药物做药物敏感性试验可为临床医生治疗鸟或胞内分枝杆菌感染选择合适的替代药物做依据。

关键词：鸟分枝杆菌胞内分枝杆菌药物敏感性

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2株胞内分枝杆菌临床分离株的鉴定

中国人兽共患病学报 2010年第3期26卷 218-221页

作者：潘爱珍张媛媛王心赵秀芹万康林中国疾病预防控制中心传染病预防控制所/传染病预防控制国家重点实验室北京102206

目的联合应用多种分子生物学技术进行分枝杆菌菌种鉴定。方法从经PNB、TCH鉴别培养基鉴定为结核分枝杆菌的临床分离菌株285株中选取6株,其中包括oxyR-ahpC基因间隔区检测时PCR产物分子量异常的2株和另外随机选择的PCR产物分子量正常者4... 详细信息

目的联合应用多种分子生物学技术进行分枝杆菌菌种鉴定。方法从经PNB、TCH鉴别培养基鉴定为结核分枝杆菌的临床分离菌株285株中选取6株,其中包括oxyR-ahpC基因间隔区检测时PCR产物分子量异常的2株和另外随机选择的PCR产物分子量正常者4株,采用H37Rv、鸟分枝杆菌95001和胞内分支杆菌95002做对照,PCR扩增oxyR-ahpC基因间隔区,对其产物进行测序和网上同源性(H37Rv、U18263、U71061)比对。同时,采用多位点PCR扩增和hsp65 PCR-限制性酶切片段长度多态性分析,从而判定分枝杆菌菌种类型。结果经PNB、TCH鉴别培养基鉴定初步判定为结核分枝杆菌的285株临床分离株中2株临床菌株oxyR-ahpC基因间隔区PCR产物大小约为1 000bp,DNA序列与胞内分枝杆菌同源性极高,达99%,而与同片段序列结核分枝杆菌H37Rv的差异大,同源性为84%。多位点PCR指纹显示为非分枝结核杆菌,hsp65 PCR-RLFP/RFLP指纹与95002一致。结论2株oxyR-ahpC基因间隔区PCR产物分子量异常的经PNB、TCH鉴别培养基鉴定为结核分枝杆菌的临床分离株确定为胞内分枝杆菌。多种分子生物学技术联合应用能够快速、简便、更准确地鉴定分枝杆菌菌种。

关键词：分枝杆菌结核分枝杆菌胞内分枝杆菌菌种鉴定

探讨胞内分枝杆菌型NTM肺病的临床与MSCT表现

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临床放射学杂志 2017年第7期36卷 981-983页

作者：姚景江贺亚琼张亚林长沙市中心医院放射科 410004 湖南省人民医院放射科

目的探讨胞内分枝杆菌非结核分枝杆菌(NTM)肺病的临床特点与CT征象。方法回顾性分析37例经临床确诊的胞内分枝杆菌型NTM肺病患者的CT资料与电子病历,并对其临床及影像学表现进行分析。结果37例患者最常见的临床症状为咳嗽咳痰,其次为咯... 详细信息

目的探讨胞内分枝杆菌非结核分枝杆菌(NTM)肺病的临床特点与CT征象。方法回顾性分析37例经临床确诊的胞内分枝杆菌型NTM肺病患者的CT资料与电子病历,并对其临床及影像学表现进行分析。结果37例患者最常见的临床症状为咳嗽咳痰,其次为咯血和活动后气促,约1/3患者原有继发型肺结核病史,1/3伴有慢性基础性肺病。最常见的CT表现为小叶中心结节即树芽征(97.3%),其次为支气管扩张(73.0%)、斑片状实变灶(54.1%)和纤维条索灶(43.2%),较少见的征象为厚壁空洞,仅见2个厚壁空洞病灶,且均位于右上肺。在合并支气管扩张患者中,右中叶和左舌叶出现支气管扩张的概率最高,分别达到56.8%和51.4%。纵隔和肺门淋巴结肿大和胸腔积液并不常见。结论胞内分枝杆菌型NTM肺病约1/3伴有慢性基础性肺病,主要CT表现为树芽征、支气管扩张、实变、结节和薄壁空洞,且支气管扩张好发于右中叶和左舌叶。

关键词：胞内分枝杆菌非结核分枝杆菌肺部疾病体层摄影术,X线计算机