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世界华人消化杂志 2007年第8期15卷 849-854页

作者：杨仕明汤旭东陈婷熊震陈陵蔡永国房殿春中国人民解放军第三军医大学西南医院全军消化病研究所重庆市400038

肝素酶(Hpa)是裂解硫酸乙酰肝素蛋白多糖的唯一酶类,能破坏细胞外基质及基底膜,参与肿瘤血管生成,与肿瘤的侵袭转移密切相关．目前的研究表明,Hpa在大多数中晚期肿瘤中都有表达,尤其在转移性肿瘤中强表达,而Hpa表达的下调可以抑制肿瘤... 详细信息

肝素酶(Hpa)是裂解硫酸乙酰肝素蛋白多糖的唯一酶类,能破坏细胞外基质及基底膜,参与肿瘤血管生成,与肿瘤的侵袭转移密切相关．目前的研究表明,Hpa在大多数中晚期肿瘤中都有表达,尤其在转移性肿瘤中强表达,而Hpa表达的下调可以抑制肿瘤细胞的转移,提示Hpa可以作为一种广谱的肿瘤转移相关抗原用于中晚期肿瘤的免疫治疗．Hpa疫苗的开发可望为中晚期肿瘤的治疗开辟新的途径．本文详细综述了Hpa的结构与功能、对肿瘤转移的促进作用及其机制、以及其作为肿瘤转移相关抗原用于中晚期肿瘤免疫治疗的可能性．

关键词：肝素酶肿瘤免疫治疗硫酸乙酰肝素蛋白多糖肿瘤转移相关抗原

肝素酶和碱性成纤维细胞生长因子在大肠癌的表达及其临床病理学意义

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肝素酶和碱性成纤维细胞生长因子在大肠癌的表达及其临床病理学意...

作者：张少然山西医科大学

学位级别：硕士

目的探讨肝素酶(heparanase)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在大肠癌组织中的表达及其与大肠癌临床病理特征之间的关系。方法采用免疫组织化学方法检测80例大肠癌和20例正常大肠黏膜石蜡切片中肝素酶和bFGF的表达情况;分析两者分别表... 详细信息

目的探讨肝素酶(heparanase)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在大肠癌组织中的表达及其与大肠癌临床病理特征之间的关系。方法采用免疫组织化学方法检测80例大肠癌和20例正常大肠黏膜石蜡切片中肝素酶和bFGF的表达情况;分析两者分别表达及共表达与大肠癌患者年龄、性别、分期、分型、分化程度、浸润深度、淋巴结转移、血管浸润及微血管密度的关系。结果免疫组织化学染色结果表明:80例大肠癌中有49例(61.3%)呈肝素酶阳性表达,52例(65.0%)呈bFGF阳性表达,主要表达在癌细胞质和(或)细胞膜中,在正常大肠黏膜上皮则呈阴性表达,肝素酶和bFGF在大肠癌中表达明显增高(P＜0.05),且两者的表达呈正相关(r=0.654,P＜0.05)。两者单独表达和共表达均与大肠癌的分期、浸润深度、淋巴结转移、血管浸润和微血管密度有关,与患者年龄、性别、大肠癌分型、分化程度无关。结论肝素酶和bFGF在大肠癌组织中的表达较正常大肠黏膜上皮明显上调,两者单独表达和共表达与大肠癌的侵袭及转移能力、肿瘤血管生成密切相关。

关键词：大肠癌肝素酶成纤维细胞生长因子

人胃癌组织中肝素酶基因启动子甲基化状态与肿瘤侵袭转移的关系

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中华实验外科杂志 2010年第4期27卷 438-440页

作者：吕清王国斌童强松郑丽端华中科技大学同济医学院附属协和医院普外科武汉430022 华中科技大学同济医学院附属协和医院病理科武汉430022

目的探讨人胃癌组织中肝素酶（HPA）基因启动子的甲基化状态及其与HPA表达、肿瘤侵袭转移的关系。方法应用免疫组织化学、逆转录一聚合酶链反应（RT—PCR）方法检测48例胃癌组织标本及相应癌旁组织中HPA蛋白和mRNA表达；采用亚硫酸氢钠... 详细信息

目的探讨人胃癌组织中肝素酶（HPA）基因启动子的甲基化状态及其与HPA表达、肿瘤侵袭转移的关系。方法应用免疫组织化学、逆转录一聚合酶链反应（RT—PCR）方法检测48例胃癌组织标本及相应癌旁组织中HPA蛋白和mRNA表达；采用亚硫酸氢钠修饰、甲基化PCR（MSP）、甲基化克隆测序（BSP）法检测胃癌组织和癌旁组织中HPA基因启动子区域CpG岛甲基化状态，并探讨与胃癌临床病理特征的关系。结果胃癌组织中HPAmRNA和蛋白的阳性表达率分别为79．20％（38／48）、93．75％（45／48），显著高于癌旁组织（P〈0．05）。MSP、BSP检测发现13例胃癌组织HPA启动子CpG岛呈低甲基化状态，且其甲基化程度与HPA的表达及胃癌的分化程度、TNM分期、淋巴结转移、远处转移明显相关（P〈0．05）。结论HPA基因启动子区域CpG岛甲基化程度与HPA的表达及胃癌的发生、发展有关，在肿瘤侵袭、转移过程中起重要调节作用。

关键词：胃癌肝素酶启动子甲基化转移

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肝素酶研究进展

中国生物工程杂志 2007年第8期27卷 116-124页

作者：陈银叶逢春况莹邢新会清华大学化学工程系生物化工研究所北京100084

微生物肝素酶是一类作用于肝素和类肝素的多糖裂解酶,在低分子肝素的制备以及肝素类分子的结构解析等领域具有十分重要的应用前景。结合微生物基因组测序的最新进展,综述微生物肝素酶的来源,并对肝素酶的作用机理加以讨论;结合实验室研... 详细信息

微生物肝素酶是一类作用于肝素和类肝素的多糖裂解酶,在低分子肝素的制备以及肝素类分子的结构解析等领域具有十分重要的应用前景。结合微生物基因组测序的最新进展,综述微生物肝素酶的来源,并对肝素酶的作用机理加以讨论;结合实验室研究对肝素酶的重组表达及其在低分子肝素生产应用的最新进展进行综述,并对肝素酶其它潜在的应用进行了讨论。

关键词：肝素酶肝素纯化重组表达应用

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人肝癌细胞肝素酶表达及其调节

人肝癌细胞肝素酶表达及其调节

作者：聂宸麟皖南医学院

学位级别：硕士

目的：分析不同的肝癌细胞肝素酶（heparanase,HPSE）的表达情况，构建人HPSE基因四种RNAi载体和真核表达载体，筛选鉴定并分析其活性，调节肝癌细胞HPSE表达。方法:用荧光定量PCR检测人肝癌细胞Bel-7402、HepG-2、HCCLM3中HPSEcDN... 详细信息

目的：分析不同的肝癌细胞肝素酶（heparanase,HPSE）的表达情况，构建人HPSE基因四种RNAi载体和真核表达载体，筛选鉴定并分析其活性，调节肝癌细胞HPSE表达。方法:用荧光定量PCR检测人肝癌细胞Bel-7402、HepG-2、HCCLM3中HPSEcDNA的表达水平。根据HSPE基因序列，针对其四处干扰靶点设计并合成4个RNAi干扰片段与线性化的miRNA载体连接，插入位点，构建人HPSE基因RNAi载体（pEGFP-1-RNAi）。聚合酶链反应扩增人类基因组DNA之HPSE基因编码区;然后双酶切插入pEGFP-1的多克隆位点，构建人HPSE真核表达载体（pIRES2-EGFP-HPSE，以下简称pEGFP-1-HPSE）;分组转染人肝癌细胞HepG-2和HCCLM3，用荧光观察和荧光定量PCR分析及电泳等方法分别检测pEGFP-1-HPSE促转录活性和四种pEGFP-1-RNAi抑制转录的活性。结果：用荧光定量PCR检测人正常肝细胞（LO-2）、人肝癌细胞Bel-7402、HepG-2、HCCLM3中HPSE cDNA分别为阴性、29.8、26.3、32.5;所构建的人肝素酶（HPSE）基因4种RNAi载体（pEGFP-1-RNAi）和真核表达载体（pEGFP-1-HPSE），经鉴定符合实验要求，所有载体均可在肝肿瘤中细胞特异性表达，并筛选出干扰HPSE表达能力最强的pEGFP-1-RNAi1，其对HPSE表达抑制作用最大。结论:HCCLM3、HepG-2、Bel-7402、三组人肝癌细胞中，HCCLM3表达最高，人正常肝细胞（LO-2）HPSE cDNA表达为阴性;成功构建了人pEGFP-1-RNAi和pEGFP-1-HPSE并筛选了有效靶点。

关键词：肝素酶 RNAi 载体

肝素黄杆菌肝素酶基因在大肠杆菌中表达的研究

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肝素黄杆菌肝素酶基因在大肠杆菌中表达的研究

作者：吴燕浙江工商大学

学位级别：硕士

肝素酶（heparanase, Hpa）是近年来研究较多的一类-D糖苷内切酶（endo-D-glucuronidase）,它既存在于正常组织,如胎盘和淋巴器官,对胚胎的形成,神经系统的发育,新生血管的形成,炎症反应等都发挥着正常的生理功能;同时也表达于多种恶性... 详细信息

肝素酶（heparanase, Hpa）是近年来研究较多的一类-D糖苷内切酶（endo-D-glucuronidase）,它既存在于正常组织,如胎盘和淋巴器官,对胚胎的形成,神经系统的发育,新生血管的形成,炎症反应等都发挥着正常的生理功能;同时也表达于多种恶性肿瘤细胞的表面,能够促进细胞的侵袭和转移,诱导肿瘤血管生成,降低肿瘤患者的生存率。肝素用于治疗和预防血栓已经有很长的历史,但是研究表明肝素有一定的副作用,例如影响血小板的稳定,从而导致手术后大出血。而分子量在4000-8000的低分子量肝素（LMWH）则能够有效地治疗血栓,但是没有明显的副作用。目前我国LMWH主要依靠进口或者来自合资企业生产,因此LMWH的生产研究具有重要的工业应用前景。而肝素酶的重要用途之一便是用于生产LMWH。针对以上问题,本课题组构建了高效表达可溶性肝素酶的重组大肠杆菌系统,获得了纯度高,活力高,性质稳定的肝素酶,极大降低了肝素酶的生产成本,使得肝素酶用于LMWH的生产成为可能。本课题组已完成了以大肠杆菌表达系统克隆表达黄杆菌肝素酶基因的工作,并以该基因作为起始材料,利用酶活测定方法筛选出高活力菌株;然后对其发酵培养基进行优化;最后对重组蛋白进行表达、纯化并研究其酶学性质。主要研究结果如下所述：提取黄杆菌肝素酶的全基因组,设计合适的引物（引入HindⅢ和EcoR Ⅰ两个酶切位点）,利用PCR技术扩增出肝素酶的ORF;同时用上述两种酶双酶切pET-28a载体和肝素酶基因,在T4连接酶的作用下连接上述目的基因与载体片段。将所得到的克隆载体转化大肠杆菌BL21菌株,在含Kan的固体LB培养基上筛选阳性可克隆子。经PCR、酶切鉴定成功后测序确定重组表达载体构建成功。以适当浓度的IPTG诱导表达肝素酶,用SDS-PAGE检测不同的诱导时间下肝素酶的表达量,从而确定最佳的诱导时间。结合酶活测定方法,得到表达肝素酶最高活性的菌株。采用两水平部分因子实验设计研究了发酵培养基各组分对肝素酶活力的影响,得出主要影响因子为蛋白胨、酵母粉和葡萄糖。三者在95%的概率水平上对菌体产酶都有正效应。然后采用BBD确定各主要影响因子的最佳作用浓度,得到优化的发酵培养基组成（g/L）：蛋白胨11.95,酵母粉7.4,葡萄糖2.74,Na2HPO4·12H2O10, MgSO4·7H2O0.5, NH4Cl3, KH2P042。在优化发酵培养基中供试菌株的酶活力是未优化发酵培养基中的1.95倍。发酵液经镍柱亲和层析纯化得到电泳纯肝素酶,SDS-PAGE电泳结果显示,经纯化得到一条单一的目的蛋白条带,经分析得该酶的分子量为42.9kDa。对纯化后肝素酶的酶学性质进行研究,发现该酶的最适反应温度为30℃,最适反应pH为7.0。该酶热稳定性较差,当温度高于60℃时,30min可完全丧失酶活。当pH范围在7-10之间时,1h内酶活基本不受影响,偏离此范围则对酶活影响较大。对比8种不同金属离子对优化后酶的活性影响,发现Ca2+和Cu2+对该酶有比较明显的激活作用,Mn2+和Pb2+对该酶有明显的抑制作用。

关键词：肝素酶克隆表达优化纯化酶学性质

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以肝素酶为靶点的抗肿瘤药物研究进展

药物生物技术 2014年第6期21卷 563-566页

作者：谭晓青崔慧斐山东大学药学院生化与生物技术药物研究所山东济南250012

恶性肿瘤一直以来都是全球范围内的热门课题,肿瘤细胞的恶性转移是肿瘤致死率居高不下的重要原因。研究发现,肝素酶(Heparanase,HPA)在肿瘤发展的过程中起关键作用,是抗肿瘤治疗的重要靶点;肝素酶抑制剂,通过降低HPA的活性或抑制HPA的表... 详细信息

恶性肿瘤一直以来都是全球范围内的热门课题,肿瘤细胞的恶性转移是肿瘤致死率居高不下的重要原因。研究发现,肝素酶(Heparanase,HPA)在肿瘤发展的过程中起关键作用,是抗肿瘤治疗的重要靶点;肝素酶抑制剂,通过降低HPA的活性或抑制HPA的表达,有效抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移,是颇具潜力的抗肿瘤治疗药物。文章对HPA作为肿瘤治疗靶点以及针对该靶点的抗肿瘤新药研发进行了综述,重点介绍了具有干扰HPA活性的底物类似物——肝素衍生物SST0001和硫酸化寡糖PG545、小分子化合物,以及抑制HPA表达的小干扰RNA(siRNA)等,为设计合理、高效的肝素酶抑制剂提供参考。

关键词：恶性肿瘤肿瘤转移肝素酶肿瘤治疗靶点肝素酶抑制剂底物类似物

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人类肝素酶B细胞表位的预测和免疫原性鉴定

中华微生物学和免疫学杂志 2009年第3期29卷 193-197页

作者：杜玲王惠菊杨建民方勇赵仲生高寒叶再元浙江省人民医院消化内科杭州310014 浙江省胃肠病学重点实验室浙江大学医学院附属邵逸夫医院肿瘤内科

目的预测并鉴定肝素酶（heparanase）蛋白B细胞表位免疫原性。方法以肝素酶蛋白的氨基酸序列为基础，采用DNAStar分析软件以及Bcepred在线二级结构分析工具分析其蛋白二级结构并预测B细胞表位。根据预测结果，采用8分支多抗原肽结构合... 详细信息

目的预测并鉴定肝素酶（heparanase）蛋白B细胞表位免疫原性。方法以肝素酶蛋白的氨基酸序列为基础，采用DNAStar分析软件以及Bcepred在线二级结构分析工具分析其蛋白二级结构并预测B细胞表位。根据预测结果，采用8分支多抗原肽结构合成针对该表位的抗原肽，将后者与通用型T辅助表位人IL-1β线性短肽（VQGEESNDK，氨基酸163～171）联合免疫日本白毛黑眼兔，检测免疫血清效价，鉴定其特异性和免疫原性。结果软件预测显示，肝素酶蛋白大亚基的第1～15位（MAP1）、第279～293位（MAP2）及175～189位（MAP3）氨基酸序列最可能为其优势B细胞表位。间接酶联免疫吸附试验、免疫印迹及免疫组化分析，证实MAP1、MAP2及MAP3均能诱导机体产生高滴度抗体，但仅MAP1、MAP2抗体具有高特异性，MAP2抗体与肝癌组织的结合力最强。结论肝素酶大亚基的第1～15位、第279～293位氨基酸为其优势B细胞表位，其中第279—293位氨基酸的免疫原性最强，这为肝素酶多肽抗体及B细胞优势短肽疫苗研制提供了理论依据。

关键词：肝素酶 B细胞表位表位预测免疫原性

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肝素酶基因过表达对小鼠肝癌细胞迁移的影响

广东医学 2008年第11期29卷 1789-1790页

作者：何瑞玲罗时敏臧林泉广东省广州市第一人民医院综合外科 510180 广东药学院新药筛选中心广州510006

目的利用构建小鼠肝素酶正义pcDNA3.1(+)表达载体转染高转移潜能肝癌细胞系(Hca-F),低转移潜能肝癌细胞系(Hca-P),观察过表达小鼠肝素酶对肝癌细胞迁移的影响。方法利用商业途径构建好的pcDNA3.1(+)-hpa质粒,利用lipofectamine2000作为... 详细信息

目的利用构建小鼠肝素酶正义pcDNA3.1(+)表达载体转染高转移潜能肝癌细胞系(Hca-F),低转移潜能肝癌细胞系(Hca-P),观察过表达小鼠肝素酶对肝癌细胞迁移的影响。方法利用商业途径构建好的pcDNA3.1(+)-hpa质粒,利用lipofectamine2000作为转染试剂,将其分别转至Hca-F、Hca-P细胞株,采用微孔迁移法观察和检测肿瘤细胞黏附和转移情况。结果转染有pcDNA3.1(+)-hpa质粒的细胞可以明显促进高转移潜能肝癌细胞系(Hca-F)和低转移潜能肝癌细胞系(Hca-P)的迁移功能(P肝素酶,可以明显促进肝癌细胞系的迁移和转移,为进一步研究阻断肝素酶基因表达治疗肝癌,明确肝癌预后靶点等奠定基础。

关键词：肝肿瘤肝素酶鼠