人肝癌细胞肝素酶表达及其调节

作     者：聂宸麟 

作者单位：皖南医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：陈晓鹏

授予年度：2014年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：肝素酶 RNAi 载体 

摘      要：目的：分析不同的肝癌细胞肝素酶（heparanase,HPSE）的表达情况，构建人HPSE基因四种RNAi载体和真核表达载体，筛选鉴定并分析其活性，调节肝癌细胞HPSE表达。 方法:用荧光定量PCR检测人肝癌细胞Bel-7402、HepG-2、HCCLM3中HPSEcDNA的表达水平。根据HSPE基因序列，针对其四处干扰靶点设计并合成4个RNAi干扰片段与线性化的miRNA载体连接，插入位点，构建人HPSE基因RNAi载体（pEGFP-1-RNAi）。聚合酶链反应扩增人类基因组DNA之HPSE基因编码区;然后双酶切插入pEGFP-1的多克隆位点，构建人HPSE真核表达载体（pIRES2-EGFP-HPSE，以下简称pEGFP-1-HPSE）;分组转染人肝癌细胞HepG-2和HCCLM3，用荧光观察和荧光定量PCR分析及电泳等方法分别检测pEGFP-1-HPSE促转录活性和四种pEGFP-1-RNAi抑制转录的活性。 结果：用荧光定量PCR检测人正常肝细胞（LO-2）、人肝癌细胞Bel-7402、HepG-2、HCCLM3中HPSE cDNA分别为阴性、29.8、26.3、32.5;所构建的人肝素酶（HPSE）基因4种RNAi载体（pEGFP-1-RNAi）和真核表达载体（pEGFP-1-HPSE），经鉴定符合实验要求，所有载体均可在肝肿瘤中细胞特异性表达，并筛选出干扰HPSE表达能力最强的pEGFP-1-RNAi1，其对HPSE表达抑制作用最大。 结论:HCCLM3、HepG-2、Bel-7402、三组人肝癌细胞中，HCCLM3表达最高，人正常肝细胞（LO-2）HPSE cDNA表达为阴性;成功构建了人pEGFP-1-RNAi和pEGFP-1-HPSE并筛选了有效靶点。