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肝素酶在人β-防御素-3抗甲型流感病毒的作用研究

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中国病原生物学杂志 2022年第1期17卷 14-17,21页

作者：杨小余马贵凤唐源罗红江滟贵州医科大学医学检验学院临床微生物与免疫学教研室贵州贵阳550025 贵州医科大学附属医院临床检验中心微生物免疫科贵州医科大学实验动物中心

目的探讨肝素酶在人β-防御素-3(Humanβ-defensin 3,HBD3)抗甲型流感病毒(Influenza A virus,IAV)中的作用。方法采用CCK8法检测肝素酶对人支气管上皮细胞(BEAS-2B)的毒性情况;经肝素酶处理BEAS-2B细胞,并在4℃下与HBD3和IAV病毒液孵育... 详细信息

目的探讨肝素酶在人β-防御素-3(Humanβ-defensin 3,HBD3)抗甲型流感病毒(Influenza A virus,IAV)中的作用。方法采用CCK8法检测肝素酶对人支气管上皮细胞(BEAS-2B)的毒性情况;经肝素酶处理BEAS-2B细胞,并在4℃下与HBD3和IAV病毒液孵育2 h,分为未处理组(HBD3+IAV),肝素酶+HBD3+IAV组,提取细胞总RNA和总蛋白,采用qRT-PCR检测感染细胞中的NP mRNA表达水平,Western blot和免疫共沉淀检测HBD3和IAV HA蛋白表达水平以及HBD3和HA蛋白的相互作用。试验设未经肝素酶处理BEAS-2B细胞对照组。结果肝素酶作用48 h,其浓度在30 U/mL以下浓度时对细胞无毒性作用;HBD3干预IAV感染细胞后细胞中的NP mRNA表达水平显著降低(t=12.81、26.13、28.68,P肝素酶处理IAV感染的细胞其NP mRNA表达水平升高(t=-4.55,P肝素酶处理IAV感染的细胞其病毒未减少,表明只使用肝素酶不能降低病毒感染;与未经肝素酶处理的细胞相比,经肝素酶处理的细胞中HBD3和HA蛋白表达水平降低,以及HBD3和HA蛋白的相互作用显著降低(P肝素酶共同作用可降低HA的表达来阻止IAV进入细胞。结论肝素酶和HBD3共同作用可以抑制病毒进入细胞,具有抗甲型流感病作用。

关键词：甲型流感病毒人β-防御素3 肝素酶糖胺聚糖蛋白

肝素酶与危重症相关肺动脉高压患者预后及病情严重程度的关系

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实用心脑肺血管病杂志 2024年第3期32卷 27-32页

作者：王林军岳建巍李建春冯菲李洪磊陈娣刘丽平兰州大学第一临床医学院甘肃省兰州市730000 兰州大学第一医院急诊重症医学科甘肃省兰州市730000

目的探讨肝素酶与危重症相关肺动脉高压(CIR-PH)患者预后及病情严重程度的关系。方法回顾性选取2021年4月-2022年6月兰州大学第一医院重症医学科收治的108例CIR-PH患者为研究对象,根据预后情况将其分为死亡组(n=28)和生存组(n=80)。... 详细信息

目的探讨肝素酶与危重症相关肺动脉高压(CIR-PH)患者预后及病情严重程度的关系。方法回顾性选取2021年4月-2022年6月兰州大学第一医院重症医学科收治的108例CIR-PH患者为研究对象,根据预后情况将其分为死亡组(n=28)和生存组(n=80)。比较两组一般资料[包括年龄、性别、BMI、肺动脉高压(PH)临床分类、肝素酶、NT-proBNP及急性生理学和慢性健康状况评价系统Ⅱ(APACHEⅡ)评分]、右心导管检查结果[包括平均肺动脉压(mPAP)、肺毛细血管楔压(PCWP)、肺血管阻力(PVR)、平均右心房压(mRAP)和心排血量(CO)]及超声心动图检查结果[包括右心室直径(RVD)、右心房直径(RAD)、肺动脉宽度(PAW)、肺动脉流速(PAV)、肺动脉压(PAP)、三尖瓣反流速度(TRV)]。CIR-PH患者预后的影响因素分析采用单因素、多因素Cox比例风险回归分析,采用ROC曲线分析肝素酶、NT-proBNP对CIR-PH患者死亡的预测价值,肝素酶与CIR-PH病情相关指标(NT-proBNP、APACHEⅡ评分、mPAP、PCWP、PVR、CO)的相关性分析采用Pearson相关分析。结果死亡组年龄、RVD、RAD大于生存组,肝素酶、NT-proBNP、APACHEⅡ评分、mPAP、PCWP、PVR、mRAP、PAP高于生存组,CO低于生存组,TRV快于生存组(P肝素酶、NT-proBNP、APACHEⅡ评分、mPAP、PCWP、PVR、mRAP、CO、RVD、RAD、PAP、TRV可能是CIR-PH患者死亡的影响因素(P肝素酶、NT-proBNP、mPAP、mRAP是CIR-PH患者死亡的独立影响因素(P肝素酶预测CIR-PH患者死亡的AUC为0.784[95%CI(0.688~0.879)],最佳截断值为10.4μg/L,灵敏度为0.500,特异度为0.875;NT-proBNP预测CIR-PH患者死亡的AUC为0.761[95%CI(0.662~0.860)],最佳截断值为3775ng/L,灵敏度为0.357,特异度为0.950。Pearson相关分析结果显示,肝素酶与CIR-PH患者NT-proBNP(r=0.639)、APACHEⅡ评分(r=0.763)、mPAP(r=0.876)、PCWP(r=0.858)、PVR(r=0.846)呈正相关,与CO(r=-0.702)呈负相关(P肝素酶是CIR-PH患者死亡的独立影响因素,其对CIR-PH患者死亡有一定预测价值,且其与CIR-PH患者病情严重程度密切相关。

关键词：肺动脉高压危重症肝素裂合酶肝素酶预后

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肝素酶调节对肝癌细胞粘附侵袭能力的影响

中国肿瘤临床 2014年第18期41卷 1180-1184页

作者：陈晓鹏罗俊生田野聂宸麟崔巍张卫东安徽省芜湖市皖南医学院附属弋矶山医院肝胆一科安徽省芜湖市241001

目的：探讨人肝素酶（HPSE）对肝癌细胞粘附、侵袭能力的影响。方法：RT-PCR、Western blot检测人肝癌细胞系BEL-7402、HepG2、HCCLM3中HPSE的表达。构建4个HPSE的miR载体pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-HPSE（pcDNA-miR-HPSE）和表达载体pIRES2-EGFP-HPSE；分别转染HPSE高表达和低表达细胞。荧光显微镜观察转染效率，RT-PCR和Western blot检测转染细胞HPSE表达；酶标仪检测细胞粘附能力，Transwell小室检测侵袭转移能力。结果：HPSE mRNA和蛋白在在3种肝癌细胞中相对表达量均高于正常肝细胞（P〈0.05），以HCCLM3表达最高，HepG2最低（P〈0.05）；4种miR载体和表达载体鉴定符合要求；转染效率75%～85%；miR载体均能抑制HCCLM3细胞HPSE表达，以pcDNA-miR-HPSE-1抑制效果最佳（P〈0.01）；表达载体可提高HepG2细胞HPSE表达（P〈0.05）；HCCLM3细胞转染pcDNA-miR-HPSE-1后，粘附率、侵袭和迁移细胞数均下降约50%（P〈0.01）；HepG2细胞转染pIRES2-EGFP-HPS后上述各指标分别升高近40%（P〈0.05）。结论：不同性质的HPSE载体可对肝癌细胞粘附和侵袭转移能力进行双向调节；HPSE不但参与肝癌细胞侵袭转移，亦可能与肝癌细胞粘附有关。

关键词：肝细胞癌肝素酶 RNA干扰载体细胞粘附侵袭

普通肝素通过肝素酶途径抑制组蛋白介导的小鼠肺内皮细胞多糖包被的损伤

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普通肝素通过肝素酶途径抑制组蛋白介导的小鼠肺内皮细胞多糖包被...

作者：付似凤中国医科大学

学位级别：硕士

目的:细胞外游离组蛋白是促进脓毒症发生发展的重要介质。内皮细胞多糖包被的降解是脓毒症主要的病理生理机制。普通肝素(Unfractionated heparin,UFH)对脓毒症患者发挥保护作用,具体机制尚不清楚。本研究旨在探讨组蛋白对内皮细胞多糖... 详细信息

目的:细胞外游离组蛋白是促进脓毒症发生发展的重要介质。内皮细胞多糖包被的降解是脓毒症主要的病理生理机制。普通肝素(Unfractionated heparin,UFH)对脓毒症患者发挥保护作用,具体机制尚不清楚。本研究旨在探讨组蛋白对内皮细胞多糖包被的损伤作用,并探讨UFH的保护作用及机制。研究方法:将40只82周龄,雄性C57BL/6小鼠按随机数字表分为对照组、组蛋白组、组蛋白+UFH组、组蛋白+肝素酶(Heparinase,HPA)抑制剂组和组蛋白+UFH+HPA抑制剂组,每组8只。小鼠腹腔注射HPA抑制剂(20mg/kg)后立即尾静脉注射组蛋白(50 mg/kg)。组蛋白给药1 h后鼠尾静脉注射UFH(400 U/kg)。其余各组相应地注射等量生理盐水。于组蛋白注射4 h后取小鼠双肺,苏木素-伊红(Hematoxylin and eosin,HE)染色后,光镜下观察肺组织病理学改变,并进行肺组织病理学评分;测量肺组织湿/干重比值(W/D)、肺组织含水量;采用实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(Realtime quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)测定肺组织组织因子(Tissue Factor,TF)、纤维蛋白原(Fibrinogen,FIB)、白细胞介素-1(Interleukin-1,IL-1)β、多配体蛋白聚糖-1(Syndecan-1)和HPA的m RNA表达;采用免疫荧光法(Immunofluorescence,IF)观察肺组织多糖包被syndecan-1和内皮细胞CD31的水平;采用免疫印迹法(Western Blot)测定肺组织syndecan-1和HPA的蛋白表达。结果:组蛋白造成小鼠肺损伤和肺水肿,促进小鼠肺组织TF、FIB、IL-1β表达,增加肺肝素酶表达,导致肺内皮细胞syndecan-1脱落。UFH下调组蛋白诱导的小鼠肺肝素酶的表达,减少肺内皮细胞syndecan-1脱落,抑制TF、Fib、IL-1β表达,减轻肺损伤和肺水肿严重程度。结论:UFH可能通过肝素酶途径减轻组蛋白诱导的肺组织内皮细胞多糖包被破坏,发挥保护作用。

关键词：组蛋白脓毒症普通肝素多糖包被肝素酶

肝素酶介导的肝癌细胞与血管内皮细胞黏附及穿内皮迁移

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中国肿瘤生物治疗杂志 2016年第5期23卷 656-662页

作者：陈晓鹏江雯张文君崔巍皖南医学院附属弋矶山医院肝胆外科安徽芜湖241001

目的:探讨肝素酶(heparanase,HPSE)对肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)细胞与血管内皮细胞黏附及穿内皮迁移的影响。方法:选用人正常脐静脉内皮细胞株HUVEC-C,肝LO-2细胞,肝癌Hep G2、BEL-7402和HCCLM3细胞,用Real-time PCR筛选高表达HPSE的HCC细胞;设计4个HPSE基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)序列、构建质粒,并筛选出最优RNAi质粒;用该RNAi质粒转染高表达HPSE的HCC细胞,同时设空白对照组、阴性对照组和未转染的HCC细胞组;黏附试验观察各组HCC细胞与HUVEC-C细胞的黏附情况;Transwell小室法观察HCC细胞穿HUVEC-C细胞迁移情况;癌细胞均以0.25%玫瑰红染色、光镜下观察;酶标仪法分别测定脱色后各组细胞D值并分析比较。结果:HCCLM3细胞HPSE mRNA表达水平显著高于肝LO-2、Hep G-2和Bel-7402细胞[(5.72±0.62)vs(1.05±0.09)、(2.65±0.31)和(3.43±0.58),均P<0.01)];设计的4个HPSE之RNAi载体,以si HPSE-3158对HPSE基因表达的抑制效果最佳(P<0.05)。RNAi组HCCLM3细胞与HUVEC-C细胞黏附率显著低于空白对照组、阴性对照组和未转染的HCCLM3细胞组[(0.31±0.04)vs(0.46±0.06)、(0.45±0.05)和(0.64±0.09),均P<0.01)]。RNAi组HCCLM3细胞穿HUVEC-C细胞迁移率也显著低于空白对照组、阴性对照组和未转染的HCCLM3细胞组[(0.28±0.03)vs(0.41±0.04)、(0.41±0.05)和(0.43±0.05),均P<0.05)]。结论:HPSE参与介导HCC细胞与血管内皮细胞的黏附及HCC细胞穿内皮迁移,可能是HCC微血管捕获、血行转移的重要因素。

关键词：肝素酶肝细胞癌血管内皮细胞微血管捕获黏附迁移

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肝素酶的表达纯化及应用研究

肝素酶的表达纯化及应用研究

作者：孙腾腾重庆邮电大学

学位级别：硕士

肝素酶是一类能够特异性地裂解肝素或者硫酸乙酰肝素类生物大分子的多糖裂解酶,其在低分子量肝素的制备、分析肝素类的分子结构以及医药等领域具有广泛的应用。其中血栓弹力图肝素酶对比试验大量应用于临床中,可指导医生合理使用抗凝类... 详细信息

肝素酶是一类能够特异性地裂解肝素或者硫酸乙酰肝素类生物大分子的多糖裂解酶,其在低分子量肝素的制备、分析肝素类的分子结构以及医药等领域具有广泛的应用。其中血栓弹力图肝素酶对比试验大量应用于临床中,可指导医生合理使用抗凝类药物。因此,肝素酶在血栓弹力图中具有广泛的应用前景。但是,目前商品化的肝素酶来源较为单一,导致肝素酶在临床中的使用价格比较高,不能被广大老百姓所接受。因此,降低肝素黄杆菌肝素酶的生产成本或者研究构建新的肝素酶重组菌具有重大的意义。本课题针对以上问题,从两个方面同时研究肝素酶的生产。一方面优化肝素黄杆菌发酵产肝素酶的工艺。另一方面选取毕赤酵母表达系统和枯草芽孢杆菌表达系统构建表达肝素酶的基因工程菌。本课题主要研究结果如下:1.构建重组肝素酶的表达系统:将编码肝素酶Ⅰ的基因序列,使用gene designer2.0软件进行密码子优化,优化后的序列利用全基因合成技术和传统的克隆技术,成功构建毕赤酵母胞外和胞内重组表达载体,和枯草芽孢杆菌分泌型表达载体。分别是p PIC9K-He E、p PIC3.5K-He E和p HT43-He E重组质粒。p PIC9K-He E和p PIC3.5K-He E分别经过限制性内切酶Sal I线性化后,通过电击法转入毕赤酵母GS115中;p HT43-He E直接通过电击法转入枯草芽孢杆菌WB800N中。获得了肝素酶重组表达的酵母和枯草杆菌。非常遗憾的是,经诱导表达,重组酵母和枯草杆菌均未检测到表达蛋白。2.肝素黄杆菌肝素酶的发酵工艺研究:对肝素黄杆菌进行复苏-培养-发酵菌生长-发酵诱导的阶段进行培养。从发酵培养基、接种发酵形式、三级发酵液发酵密度和肝素钠诱导时间四个方进行肝素黄杆菌发酵工艺研究。发现以单克隆的形式在LB培养基中发酵培养肝素黄杆菌更加有利于产酶;当三级菌液稀释5倍的OD600在2.5-3.1之间加入肝素钠,诱导8h后。肝素黄杆菌的表达量较高,最高能够达到183IU/g。3.肝素酶的分离纯化:分别对粗酶液进行Q HP和SP FF层析柱条件的优化,探索出完整的纯化流程。首先肝素酶在PH9.0的环境下穿透Q HP层析柱,其次Q HP穿透液在p H7.0的环境下过SP FF层析柱,此时大约90%的肝素酶是挂柱状态,使用0.3M Na Cl的缓冲液洗脱肝素酶,最后将SP FF洗脱液上样到Cellufine Sulfate层析柱,使用相同的盐浓度洗脱目的蛋白。最终可达到电泳纯,其比酶活是粗酶液的625倍。4.肝素酶在血栓弹力图中的应用:将经过三步纯化的肝素酶进行透析、超滤浓缩和冻干,制备成血栓弹力图肝素酶检测杯。经对肝素处理的血液检测,表明自制的血栓弹力图肝素酶检测杯具有一定中和肝素的能力。

关键词：肝素酶毕赤酵母枯草芽孢杆菌肝素黄杆菌血栓弹力图

肝素酶对血管内皮细胞粘附分子P选择素表达的影响

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肝素酶对血管内皮细胞粘附分子P选择素表达的影响

作者：陈青云皖南医学院

学位级别：硕士

目的:构建RNAi干扰肝癌细胞株HePG-2,通过实验观察各种肝素酶不同表达水平的肝癌细胞对血管内皮细胞粘附分子表达的影响,完善并丰富肝素酶在肝癌侵袭转移中的分子学研究。方法:(1)选用肝癌细胞株HePG-2作为研究的实验细胞,运用抑制肝素... 详细信息

目的:构建RNAi干扰肝癌细胞株HePG-2,通过实验观察各种肝素酶不同表达水平的肝癌细胞对血管内皮细胞粘附分子表达的影响,完善并丰富肝素酶在肝癌侵袭转移中的分子学研究。方法:(1)选用肝癌细胞株HePG-2作为研究的实验细胞,运用抑制肝素酶的基因对HePG-2进行细胞转染,通过qRT-PCR及Western-blot等实验方法检测各组转染细胞中HPSE基因表达的水平;(2)通过上述方法选择出相应的HePG-2细胞分为转染组(RNAi干扰的HePG-2细胞)、阴性对照组(转染阴性的HePG-2细胞)、空白对照组(未转染的HePG-2细胞)三组实验细胞进行细胞粘附实验,通过qRT-PCR及Western-blot等实验方法分析各实验组细胞粘附分子表达的影响。结果:(1)运用qRT-PCR及Western-blot等实验方法分析刷选,成功得到最佳干扰的HePG-2细胞;(2)qRT-PCR和Western-blot结果:未转染的HePG-2细胞对血管内皮细胞粘附分子表达有明显增强;RNAi干扰的HePG-2细胞对血管内皮细胞粘附分子表达有明显降低;转染阴性的HePG-2细胞对血管内皮细胞粘附分子表达相对空白对照组有所降低,但高于RNAi干扰的HePG-2细胞组。结论:通过qRT-PCR及Western-blot等实验方法证实肝素酶对肝癌细胞在与血管内皮细胞粘附的作用过程中发挥了相关重要的的作用,参与介导了肝癌细胞与血管内皮细胞的粘附。

关键词：肝素酶肝癌粘附分子

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肝素酶介导的裸鼠肝癌门静脉微瘤栓形成

第三军医大学学报 2016年第21期38卷 2297-2302页

作者：陈晓鹏岳朝辅卢林明张文君皖南医学院弋矶山医院肝胆外科安徽芜湖241001 皖南医学院弋矶山医院病理科安徽芜湖241001

目的探寻肝癌细胞中高表达的肝素酶(heparanase,HPSE)对裸鼠肝癌门静脉微瘤栓形成的影响。方法根据既往研究结果,分别选取高表达和相对较低表达HPSE的HCCLM3和Hep G2两种人肝癌细胞;调整细胞浓度,行裸鼠下腹腔注射3×106个癌细胞(均300... 详细信息

目的探寻肝癌细胞中高表达的肝素酶(heparanase,HPSE)对裸鼠肝癌门静脉微瘤栓形成的影响。方法根据既往研究结果,分别选取高表达和相对较低表达HPSE的HCCLM3和Hep G2两种人肝癌细胞;调整细胞浓度,行裸鼠下腹腔注射3×106个癌细胞(均300μL);至第3周和第5周时,分别取标本观察网膜和肝脏成瘤率、血管侵犯和门静脉微瘤栓形成情况,以建立肝癌微瘤栓模型和普通肝癌模型。模型鉴定并复制,然后于腹腔注射癌细胞后第2周开始分别皮下注射250 IU的HPSE抑制剂肝素钠,1次/3 d,共2周,并设生理盐水作为对照;仍于细胞注射第3周和第5周时,观察上述指标。结果裸鼠腹腔接种后一般情况无改变;第3周时体质量明显增加(P肝素钠皮下注射至接种第3周时,HCCLM3细胞网膜及肝脏转移、血管侵犯及微瘤栓形成显著少于生理盐水组(P肝素组HCCLM3细胞所致的网膜和肝脏成瘤、血管侵犯和门静脉微瘤栓形成率仍明显少于生理盐水组(P<0.05)。结论腹腔注射高表达HPSE的HCCLM3细胞可成功介导肝癌门静脉微瘤栓形成;HPSE可能是微瘤栓形成重要因素。

关键词：肝素酶肝细胞癌门静脉瘤栓血管侵犯

不同来源肝素酶Ⅰ对依诺肝素钠降解作用的研究

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药物分析杂志 2020年第7期40卷 1254-1261页

作者：朱梦李笃信杨凯歌李富川张真庆苏州大学药学院苏州215006 山东大学糖工程中心济南250100

目的:探索不同来源的肝素酶Ⅰ对依诺肝素钠降解特性的差异,以及依诺肝素钠精细结构表征,为此类药物的质量控制提供理论依据。方法:考察3种肝素酶Ⅰ在不同条件下对依诺肝素钠的降解特点,并利用离子交换色谱法纯化降解产物,之后进行质谱... 详细信息

目的:探索不同来源的肝素酶Ⅰ对依诺肝素钠降解特性的差异,以及依诺肝素钠精细结构表征,为此类药物的质量控制提供理论依据。方法:考察3种肝素酶Ⅰ在不同条件下对依诺肝素钠的降解特点,并利用离子交换色谱法纯化降解产物,之后进行质谱和核磁共振分析,获得结构信息,从而阐述降解产物组成和降解效率的差异。结果:不同来源的肝素酶Ⅰ对依诺肝素钠的降解效果不同。大肠杆菌表达体系的融合蛋白肝素酶Ⅰ的降解效率要高于来源于肝素黄杆菌的原生肝素酶Ⅰ,而大肠杆菌表达体系的重组肝素酶Ⅰ效率最低。经离子交换纯化获得数个寡糖,通过结构确认的1个寡糖组分(ΔUA2S-Glc NS6S-Ido A2SGlcNS6S)在第1和第2种酶的降解产物中没有发现,而在第3种酶的降解产物中始终存在。结论:本文比较了3种不同来源肝素酶Ⅰ降解依诺肝素钠过程中的细微差异,为以肝素酶降解为基础的依诺肝素钠结构研究和质量控制提供了有效支持。

关键词：肝素酶裂解酶依诺肝素钠降解特性寡糖高效液相色谱核磁共振结构解析