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茶叶科学 2015年第1期35卷 35-44页

作者：姚胜波王文钊李明卓许玉娇王云生刘亚军高丽萍夏涛安徽农业大学教育部茶叶生物化学与生物技术重点实验室安徽合肥230036 安徽农业大学生命科学学院安徽合肥230036

肉桂酸4-羟基化酶(Cinnamate 4-hydroxylase,C4H)是茶树苯丙烷代谢途径中的关键酶,能够影响木质素和类黄酮等次级代谢物的生物合成。本文采用5′-RACE技术,克隆了茶树肉桂酸4-羟基化酶基因(Cs C4H)的全长序列,其中开放阅读框长1 518 bp... 详细信息

肉桂酸4-羟基化酶(Cinnamate 4-hydroxylase,C4H)是茶树苯丙烷代谢途径中的关键酶,能够影响木质素和类黄酮等次级代谢物的生物合成。本文采用5′-RACE技术,克隆了茶树肉桂酸4-羟基化酶基因(Cs C4H)的全长序列,其中开放阅读框长1 518 bp,编码505个氨基酸,推测蛋白分子量为58.15 k D,理论等电点为9.29。利用基因组步移技术克隆得到该基因上游1 840 bp的启动子序列。该启动子区域除了分布有TAAT-box和CAAT-box等基本转录元件外,还存在多个诱导型和组织特异型的顺式作用元件。实时荧光定量PCR结果表明该基因在芽、叶、茎、根中都有表达。将该基因重组至表达载体p YES-DEST52上,并在酿酒酵母WAT11中进行真核表达。利用LC-MS方法检测酶反应产物,结果表明目的蛋白能够催化肉桂酸生成p-香豆酸。

关键词：茶树肉桂酸4-羟基化酶启动子表达分析真核表达

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荸荠肉桂酸4-羟基化酶基因的克隆及其在鲜切荸荠黄化过程中的表达分析

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基因组学与应用生物学 2020年第2期39卷 666-673页

作者：宋慕波周伟政唐永胜陈振林帅良段振华贺州学院食品科学与工程技术研究院贺州542899 广西果蔬保鲜和深加工人才小高地贺州542899 荔浦县产品质量检验所桂林546600

肉桂酸4-羟基化酶(cinnamic acid 4-hydroxylase,C4H)是苯丙烷代谢途径中的关键酶,在植物黄酮类物质合成代谢过程中发挥重要作用。鲜切荸荠贮藏过程中由于黄酮类物质积累而导致的黄化现象很可能离不开C4H的参与。本研究利用RACE技术在... 详细信息

肉桂酸4-羟基化酶(cinnamic acid 4-hydroxylase,C4H)是苯丙烷代谢途径中的关键酶,在植物黄酮类物质合成代谢过程中发挥重要作用。鲜切荸荠贮藏过程中由于黄酮类物质积累而导致的黄化现象很可能离不开C4H的参与。本研究利用RACE技术在荸荠中克隆得到C4H基因cDNA全长,命名为Cw C4H(GenBank登录号:MG719237),该序列长度为1736 bp,编码一条由505个氨基酸组成的多肽,分子量为57.826 kD。Cw C4H包含细胞色素P450结构域,其二级结构以α-螺旋为主。多重比对结果表明,CwC4H具有该基因家族特有的保守结构域并与其它植物的C4H蛋白有很高的相似性。系统进化分析表明CwC4H与高粱C4H蛋白亲缘关系较近。荧光定量PCR分析表明,鲜切荸荠黄化过程中Cw C4H表达量快速上升,水杨酸处理抑制了鲜切荸荠的黄化和CwC4H的表达。

关键词：鲜切荸荠肉桂酸4-羟基化酶基因克隆表达分析

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紫苏肉桂酸4-羟基化酶基因的克隆与分析

紫苏肉桂酸4-羟基化酶基因的克隆与分析

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作者：宋西红天津科技大学

学位级别：硕士

本实验以唇形科植物紫苏(Perilla frutescens)为研究对象,首次从紫苏中克隆得到了迷迭香酸合成途径中苯丙氨酸途径中第二个关键酶肉桂酸4-羟基化酶(Cinnamate-4-hydroxylase, C4H)基因的cDNA和基因组DNA全长序列,cDNA全长命名为PerC4H (... 详细信息

本实验以唇形科植物紫苏(Perilla frutescens)为研究对象,首次从紫苏中克隆得到了迷迭香酸合成途径中苯丙氨酸途径中第二个关键酶肉桂酸4-羟基化酶(Cinnamate-4-hydroxylase, C4H)基因的cDNA和基因组DNA全长序列,cDNA全长命名为PerC4H (GenBank登录号：KM434189),并对该基因进行了生物信息学分析和基因表达分析。通过已报道的唇形科植物黄芩、丹参和藿香的C4H基因序列比对,在保守序列区域设计简并引物,利用RT-PCR技术扩增得到PerC4H基因的部分序列片段,然后利用cDNA末端快速扩增(Rapid amplification of cDNA ends, RACE)技术克隆得到1667bp的cDNA全长,其中包含1518bp的开放阅读框(ORF),编码505个氨基酸残基,含有长度为21bp的5q}编码区(5’UTR)和93bp的3qE编码区(3’UTR)。并设计全长引物克隆得到该cDNA序列对应的DNA序列全长2087bp,有三个外显子和两个内含子,外显子长度分别为777bp、133bp和731bp,两个内含子的长度分别为376bp和70bp。经BLAST基因比对,得到的紫苏C4H基因的cDNA全长序列与已报道其它物种的C4H基因具有很高的相似性,与唇形科植物黄芩(Scutellaria baicalensis)、丹参(Salvia miltiorrhiza)和藿香(Agastache rugosus)核苷酸的一致性分别为86.96%、86.10%和82.81%,编码的氨基酸的一致性为89.55%、92.48%和90.30%。利用生物信息学软件对克隆得到的紫苏C4H基因进行分析,结果表明：其编码的氨基酸是一个亲水性蛋白,不具有跨膜结构域。经NCBI结构域分析表明该基因ORF翻译的氨基酸序列有典型的细胞色素P450家族中c112078亚家族的保守结构域。紫苏C4H蛋白的二级结构预测显示其含有47.92%的α螺旋,12.67%的延伸链,4.36%的β折叠,35.05%的无规则卷曲。对其高级结构进行预测,得到了紫苏C4H蛋白的三维结构模型。C4H系统进化树分析则表明紫苏C4H有明显的种属特性,且紫苏C4H与唇形科植物C4H亲缘关系最近。以紫苏β-Actin基因作内参,采用荧光实时定量PCR方法对C4H基因表达进行分析,结果表明紫苏C4H基因在根中的表达丰度最高,茎中次之,叶中最低。500gMMeJA和250mg/L的赤霉素在一定程度上均上调紫苏C4H基因的相对表达水平,而100μM的ABA和黑暗处理则明显降低紫苏C4H的表达量。对紫苏C4H基因的表达初步探究为进一步的研究该酶与迷迭香酸产量的积累之间的关系的深入研究提供参考。

关键词：紫苏肉桂酸4-羟基化酶基因克隆表达分析

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紫苏肉桂酸4-羟基化酶基因的克隆与表达

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广东农业科学 2015年第11期42卷 124-129页

作者：宋西红郝磊吕晓玲郭宇魏曼赵辰辰天津科技大学食品工程与生物技术学院天津300457

为阐述紫苏中迷迭香酸合成的分子调节机制,应用同源克隆和RACE技术首次从紫苏叶片中克隆得到肉桂酸-4-羟基化酶基因(Per C4H)的全长c DNA序列(Gen Bank登录号:KM434189)。Per C4H基因总长度为1 667 bp,基因的开放阅读框(ORF)为1 518 bp... 详细信息

为阐述紫苏中迷迭香酸合成的分子调节机制,应用同源克隆和RACE技术首次从紫苏叶片中克隆得到肉桂酸-4-羟基化酶基因(Per C4H)的全长c DNA序列(Gen Bank登录号:KM434189)。Per C4H基因总长度为1 667 bp,基因的开放阅读框(ORF)为1 518 bp,编码505个氨基酸残基,还含有长度为21 bp的5′非编码区(5′UTR)和95 bp的3′非编码区(3′UTR)。系统进化树分析得到Per C4H基因与唇形科植物丹参和黄芩的亲缘性最近。由实时荧光定量PCR分析可知,该基因在紫苏中具有组织表达特异性,根中的表达最高,茎中次之,而叶中最少。一定浓度的赤霉素与茉莉酸甲酯能提高Per C4H的表达量,而脱落酸和黑暗处理能降低Per C4H的表达量。

关键词：紫苏迷迭香酸肉桂酸4-羟基化酶基因克隆表达分析

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利用真核表达体系验证茶树UGT84A22和C4H基因的功能

利用真核表达体系验证茶树UGT84A22和C4H基因的功能

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作者：姚胜波安徽农业大学

学位级别：硕士

多酚类物质是茶树次生代谢的特征成分,同时也是茶叶有益人体健康的重要组成成分,影响着茶叶色泽、香气、滋味等感官品质的形成。茶树的多酚类物质及其衍生物种类复杂多样,其生物合成主要途径涉及莽草酸途径,苯丙烷代谢途径和类黄酮合成... 详细信息

多酚类物质是茶树次生代谢的特征成分,同时也是茶叶有益人体健康的重要组成成分,影响着茶叶色泽、香气、滋味等感官品质的形成。茶树的多酚类物质及其衍生物种类复杂多样,其生物合成主要途径涉及莽草酸途径,苯丙烷代谢途径和类黄酮合成途径,同时还涉及一些衍生化途径,如甲基化、酰基化、糖苷化和羟基化等。本文重点研究酚类物质糖苷化和羟基化的相关基因及其功能,能够为深入了解茶树多酚类物质代谢调控提供基础,对于开展茶树新品种选育工作和研究茶叶品质形成机理具有一定的指导意义。本文利用生物信息学手段对茶树转录组数据库中的UGTs基因进行筛选、分类和基序分析;利用真核表达体系对本实验室已克隆全长的CsUGT84A22基因进行功能验证。利用RACE技术和基因组步移技术分别克隆CsC4H基因全长及其启动子序列,并利用真核表达体系验证CsC4H基因功能;利用qRT-PCR技术分析CsC4H基因在不同发育组织和器官的表达特异性;利用根癌农杆菌介导的烟草瞬时表达技术和激光共聚焦显微镜观察和分析CsC4H带GFP标签融合蛋白在植物体内的亚细胞定位情况。主要研究结果如下:1.基于NCBI登陆的5个茶树转录组数据库(PRJNA167330、PRJNA223181、PRJNA51793、PRJNA170701、PRJNA261465)以及本实验室通过高通量测序获得的茶树转录组数据,结合基因功能注释、PSPG box的44个保守氨基酸序列以及同源序列检索等手段,共筛选得到178条CsUGTs基因,其中129条具有C末端保守区。2.利用MEGA6.0软件对132条氨基酸序列长度在25022之间的CsUGTs构建系统进化树。结果显示:茶树中的UGTs可以被划分为16个系统发育组(A-M、O、P、R)。较拟南芥和其他植物不同的是,茶树中没有发现N组和Q组,但是可以划分出一个新的R组。利用Weblogo软件对各系统发育组的茶树UGTs与其他植物UGTs进行基序分析,得到PSPG box序列上保守氨基酸残基出现相对频率的分布图。3.在茶树UGT进化树分析的结果上,本实验选择CsUGT84A22基因进行真核表达。将构建成功的pYES-CsUGT84A22重组质粒转化至真核表达菌株酿酒酵母WAT11。对半乳糖诱导后的酵母细胞充分破碎,高速离心取上清液进行酶活反应。HPLC技术检测酶产物的结果表明:CsUGT84A22重组蛋白具有以UDP-葡萄糖为糖供体催化酚酸形成糖酯的活性。4.在茶树肉桂酸4-羟基化酶基因EST序列基础上,通过RACE技术克隆了CsC4H基因的全长序列,其中开放阅读框长度为1518 bp,编码505个氨基酸,预测蛋白的分子量为58.15 kD,理论等电点为9.29。利用基因组步移技术克隆得到CsC4H起始密码子上游1840 bp的启动子序列。该启动子区域除了分布有TAAT-box和CAAT-box等基本转录元件外,还存在多个诱导型和组织特异型的顺式作用元件。5.实时荧光定量PCR结果表明:CsC4H基因在芽、叶、茎、根中都有表达。亚细胞定位结果表明:CsC4H重组蛋白是分布比较广泛的膜蛋白,绿色荧光主要分布在叶绿体膜上,内质网膜上以及细胞质膜上。6.将构建成功的pYES-CsC4H重组质粒转化至真核表达菌株酿酒酵母WAT11。通过向半乳糖诱导后的菌液饲喂底物肉桂酸进行酶活反应,HPLC技术检测酶产物的结果表明:CsC4H重组蛋白具有催化肉桂酸生成p-香豆酸的生物活性。

关键词：茶树糖基转移酶肉桂酸4-羟基化酶启动子真核表达

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