利用真核表达体系验证茶树UGT84A22和C4H基因的功能

作     者：姚胜波 

作者单位：安徽农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：夏涛;高丽萍

授予年度：2015年

学科分类：09[农学] 090203[农学-茶学] 0902[农学-园艺学] 

主      题：茶树 糖基转移酶 肉桂酸4-羟基化酶 启动子 真核表达 

摘      要：多酚类物质是茶树次生代谢的特征成分,同时也是茶叶有益人体健康的重要组成成分,影响着茶叶色泽、香气、滋味等感官品质的形成。茶树的多酚类物质及其衍生物种类复杂多样,其生物合成主要途径涉及莽草酸途径,苯丙烷代谢途径和类黄酮合成途径,同时还涉及一些衍生化途径,如甲基化、酰基化、糖苷化和羟基化等。本文重点研究酚类物质糖苷化和羟基化的相关基因及其功能,能够为深入了解茶树多酚类物质代谢调控提供基础,对于开展茶树新品种选育工作和研究茶叶品质形成机理具有一定的指导意义。本文利用生物信息学手段对茶树转录组数据库中的UGTs基因进行筛选、分类和基序分析;利用真核表达体系对本实验室已克隆全长的CsUGT84A22基因进行功能验证。利用RACE技术和基因组步移技术分别克隆CsC4H基因全长及其启动子序列,并利用真核表达体系验证CsC4H基因功能;利用qRT-PCR技术分析CsC4H基因在不同发育组织和器官的表达特异性;利用根癌农杆菌介导的烟草瞬时表达技术和激光共聚焦显微镜观察和分析CsC4H带GFP标签融合蛋白在植物体内的亚细胞定位情况。主要研究结果如下:1.基于NCBI登陆的5个茶树转录组数据库(PRJNA167330、PRJNA223181、PRJNA51793、PRJNA170701、PRJNA261465)以及本实验室通过高通量测序获得的茶树转录组数据,结合基因功能注释、PSPG box的44个保守氨基酸序列以及同源序列检索等手段,共筛选得到178条CsUGTs基因,其中129条具有C末端保守区。2.利用MEGA6.0软件对132条氨基酸序列长度在25022之间的CsUGTs构建系统进化树。结果显示:茶树中的UGTs可以被划分为16个系统发育组(A-M、O、P、R)。较拟南芥和其他植物不同的是,茶树中没有发现N组和Q组,但是可以划分出一个新的R组。利用Weblogo软件对各系统发育组的茶树UGTs与其他植物UGTs进行基序分析,得到PSPG box序列上保守氨基酸残基出现相对频率的分布图。3.在茶树UGT进化树分析的结果上,本实验选择CsUGT84A22基因进行真核表达。将构建成功的pYES-CsUGT84A22重组质粒转化至真核表达菌株酿酒酵母WAT11。对半乳糖诱导后的酵母细胞充分破碎,高速离心取上清液进行酶活反应。HPLC技术检测酶产物的结果表明:CsUGT84A22重组蛋白具有以UDP-葡萄糖为糖供体催化酚酸形成糖酯的活性。4.在茶树肉桂酸4-羟基化酶基因EST序列基础上,通过RACE技术克隆了CsC4H基因的全长序列,其中开放阅读框长度为1518 bp,编码505个氨基酸,预测蛋白的分子量为58.15 kD,理论等电点为9.29。利用基因组步移技术克隆得到CsC4H起始密码子上游1840 bp的启动子序列。该启动子区域除了分布有TAAT-box和CAAT-box等基本转录元件外,还存在多个诱导型和组织特异型的顺式作用元件。5.实时荧光定量PCR结果表明:CsC4H基因在芽、叶、茎、根中都有表达。亚细胞定位结果表明:CsC4H重组蛋白是分布比较广泛的膜蛋白,绿色荧光主要分布在叶绿体膜上,内质网膜上以及细胞质膜上。6.将构建成功的pYES-CsC4H重组质粒转化至真核表达菌株酿酒酵母WAT11。通过向半乳糖诱导后的菌液饲喂底物肉桂酸进行酶活反应,HPLC技术检测酶产物的结果表明:CsC4H重组蛋白具有催化肉桂酸生成p-香豆酸的生物活性。